Transformación bacteriana: electroporación

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Summary

El término "transformación" refiere a la ingestión celular de ADN extraño. En la naturaleza, la transformación puede ocurrir en ciertos tipos de bacterias. En biología molecular, sin embargo, transformación es inducida artificialmente a través de la creación de poros en las paredes celulares bacterianas. Las células bacterianas que son capaces de tomar ADN del ambiente se denominan células competentes. Espectro de células se pueden producir en el laboratorio y la transformación de estas células se puede lograr mediante la aplicación de un campo eléctrico que crea poros en la pared celular a través del cual el ADN puede pasar.

El video explica el equipo utilizado en la electroporación como una cubeta electroporator y electroporación. El video también pasa a través de un procedimiento paso a paso sobre cómo crear células de espectro y electroporate las células de interés. Predicción del éxito de una transformación de un experimento, mediante la observación de la constante de tiempo, así como la importancia de eliminar la sal de las soluciones cuando electroporating, también se mencionan.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Métodos Básicos en Biología Celular y Molecular. Transformación bacteriana: electroporación. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Transformación bacteriana es un proceso natural, en el cual las bacterias ingieren ADN extraño y luego amplificarán o clonación. En el laboratorio, este proceso puede ser inducido artificialmente, mediante el uso de pulsos de campo eléctrico de alto voltaje para crear poros en la membrana celular bacteriana, a través de la cual el plásmido ADN puede pasar. La electroporación se refiere a este método y en el siguiente vídeo se demuestra sus principios, procedimiento paso a paso y aplicaciones.

Antes de hablar de la electroporación de bacterias, es importante entender el tipo de ADN utilizado en estos experimentos: el plásmido. Un plásmido es un pequeño, circular, extracromosómico de ADN que actúa como un vector, un portador de su secuencia de ADN específica.

Si esta secuencia es un gene para una proteína de la fluorescencia en Medusa o una enzima de las plantas, se inserta en el plásmido por medio de una región llamada la múltiple clonación sitio o MCS. Esta región contiene secuencias específicas que están divididas por restricción de endonucleasas o enzimas de restricción. Las mismas enzimas de la restricción puede utilizarse para cortar la secuencia de interés para que los extremos son complementarios a los extremos recién cortados del plásmido.

Plásmidos también contienen un origen de replicación, abreviado ORI, que indica el punto en el que se replicará. Cuando se trata de la transformación el gen de resistencia a los antibióticos es de vital importancia. Como su nombre lo indica este gen permite que las bacterias producen una enzima que neutraliza el antibiótico, lo que les permite sobrevivir en medios que contienen antibióticos.

Electroporación hace uso de un dispositivo especializado llamado un electroporator. Normalmente las células se colocan en una cubeta de electroporación, que tiene electrodos en cada lado que hacen contacto eléctrico con la máquina una vez insertada.

Mezclado con ADN de células bacterianas se cargan en la cubeta de electroporación y se aplica un campo eléctrico en el pedido de una 1000 a 10.000 voltios por centímetro durante unas milisegundos. Esto hace que la tensión a través de la membrana alcance 0.5-1 voltios, que se cree que conducen a un cambio del phospolipid bilayer que consta de la membrana celular que forman los poros. En este plásmido estado ADN pasará a través de la membrana y cuando termine pulsar la bicapa repararse a sí mismo.

Después de haber tomado el plásmido, pueden entonces desarrollarse bacterias en placas de agar que contiene antibióticos.

Ahora que hemos aprendido sobre los plásmidos y el mecanismo de la electroporación. Vamos a echar un vistazo a cómo se realiza el procedimiento.

Las células que pueden fácilmente tomar el ADN se conocen como células competentes. El tipo más común de bacterias competentes que se transforma en investigación de biología molecular es e. coli, las bacterias procariotas que tienen su hogar en su intestino inferior. E. coli que se preparan para la electroporación se denominan células de espectro.

Cuando maneje las bacterias, asegúrese de que el área de trabajo es tan limpio como sea posible.

Manipulación de bacterias también requiere una técnica aséptica una práctica. Esto implica típicamente el uso de un mechero de Bunsen para esterilizar instrumentos y crear una convección actual – que mantiene contaminantes en el aire lejos del área de trabajo.

Inmediatamente antes de la electroporación, medios precalentamiento a temperatura ambiente, llevar las placas de agar que contiene antibiótico a 37 ° C y cubetas de electroporación fresco en hielo.

A continuación, descongelar células lavadas espectro en hielo.

Agregar 1-5uL de plásmido frío 1ng/μ que es sal gratis a las células bacterianas, mezclar suavemente y añadir la mezcla a la cubeta fría. Asegúrese de que no hay burbujas.

Establece la fuerza de tensión y campo de la electroporator en la configuración correcta para sus células. Aquí puede ver un electroporator está situado a 1700 voltios y produciendo una fuerza de campo de 17kV/cm.

Seque el exterior de la cubeta y colocar en el electroporator. Pulso de las células hasta que escuche un sonido.

Pulsación provoca una descarga eléctrica, que es observable como una chispa visible y audible pop. Esta descarga, conocida como arco eléctrico, puede ser el resultado de tener demasiada sal en tus células competentes o ADN.

Señalando la constante de tiempo, que es la duración que tarda la tensión decaiga después de aplicar el pulso se puede predecir el éxito de su transformación. Cuando la sal está presente y la electroporación solución es muy conductora, el decaimiento ocurre rápidamente, causando la descarga y así matando a muchas de sus células. Para bacterias, rango de constantes de tiempo de 5 a 10 milisegundos.

Inmediatamente después de la pulsación, sacar la cubeta y añadir 1 ml de medios de comunicación directamente a las células. Esta célula que contiene los medios de comunicación se coloca en un tubo y se incubó a 37° C durante 1 hora, con agitación, en el orden de las células a recuperar.

Luego, utilizando una técnica aséptica Añadir 20-200uL de la célula a un antibiótico que contiene la placa de agar. Invertir las placas para que el agar está en la parte superior y para que condensación no caiga en tus células e incubar durante una noche a 37° C.

Las bacterias transformadas con el plásmido deben formar colonias. Contar las colonias y calcular la eficiencia de transformación, que es el número de transformantes éxito dividido por la cantidad total de ADN plateado.

El agar y medios de comunicación, que proporcionan la nutrición para la bacteria, deben ser previamente preparado y esterilizado mediante autoclave. Permite medio líquido a enfriar a temperatura ambiente antes de usar y deje enfriar el agar a 50-55˚C – la temperatura a la que pueden añadirse antibióticos y vertieron de placas. Luego, deje que platos se enfríen a temperatura ambiente para solidificar.

Puesto que las bacterias utilizadas en la transformación se almacenan en el congelador, primero debe descongelar en el hielo, extender sobre una placa de agar sin antibióticos y luego crecido durante la noche en 37˚C.

Utilizando una técnica aséptica Seleccione una colonia de bacterias de la placa de agar y crecer en una cultura más grande de 500mL durante la noche a 37° C en un incubador de agitación.

Mientras que las células crecen, prepare sobre un litro de agua desionizada y hacen un 10% de glicerol y agua, volumen a volumen de solución. Autoclave de las soluciones y se dejan enfriar a 4.

Las mediciones de absorbancia se utilizan para determinar si es o no la bacteria en su mediados fase logarítmica de crecimiento, lo cual significa que fácilmente se ocupan de ADN. Una vez que las células han alcanzado esta fase, coloque en hielo y mantenerlos allí durante todo el procedimiento.

A continuación, lave las células mediante la separación en dos tubos de centrífuga de gran vuelta a 4° C, retirar el sobrenadante y resuspender en frio 100mL de agua desionizada estéril. Repita este paso por lo menos una vez más. El propósito de este paso particular es quitar la sal, que afectará fuertemente a la técnica de electroporación.

Realizar dos lavados adicionales en 50 ml de glicerol al 10% en agua y finalmente resuspender las bacterias de esta misma solución.

Añadir 50μL de células en múltiples tubos Eppendorf. Estas células están ahora listas para uso de electroporación y deben conservarse a 4. O pueden ser flashes congelado y almacenado a - 80˚C.

Como usted está a punto de ver, electroporación tiene muchas aplicaciones.

Una alternativa a la electroporación es transformación de choque de calor, que se basa en la exposición de las bacterias al calor y cloruro de calcio para introducir ADN en tus células.

En general, el choque térmico es más suave en sus bacterias de electroporación y no requiere bajo en sal. Las reacciones de ligadura, los que implican la inserción de su gene de la blanco en el plásmido, pueden utilizarse directamente en la transformación de choque de calor. Transformación de choque de calor es más barato que la electroporación y no depende de costosos aparatos o cubetas. Por otro lado, golpes de calor conduce a disminuir la eficiencia de transformación de electroporación y demora más. También se limita a bacterias, levaduras y plantas protoplastos mientras que la electroporación se puede aplicar a células de mamíferos.

Aquí se puede apreciar fibroblastos embrionarios de ratón se carga en una cubeta de electroporación. Una vez completada la electroporación, eficiencias de transformación se pueden determinar mediante la observación de la medida en que las células producen una proteína de fluorescencia verde codificada por el plásmido. La transfección es el término dado a la transformación de células de mamífero, que típicamente requiere de intensidades de campo menor que las células bacterianas y las constantes de tiempo mayor.

La electroporación también se puede realizar en su totalidad animales como el embrión de pollo en desarrollo visto aquí. Plásmido ADN es inyectado en el cerebro de la chica y luego se utiliza una sonda de electroporación para aplicar un campo eléctrico en el tejido cerebral. Después de un día o dos, las proteínas fluorescentes verdes y rojas - codificadas por el plásmido - son hechas por las neuronas, y los científicos pueden observar cambios estructurales en el cerebro de pollito en desarrollo.

Sólo ha visto introducción de Zeus a la transformación bacteriana por electroporación. Este video introducido el plásmido como el tipo más comúnmente transformado de ADN, discute el mecanismo biofísico cree que subyacen a la electroporación, demostrada un procedimiento generalizado para la realización de electroporación y describe cómo puede ser la electroporación utilizado en sistema de mammalisn. ¡Gracias por ver!

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