Overview
Un análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) se realiza generalmente para detectar la presencia o la cantidad de una proteína diana de interés dentro de una muestra experimental. Detección de la proteína Diana es hecha posible por los anticuerpos, que hacen el ELISA de un inmunoensayo. A través de una serie de incubación y de pasos de lavado, estos anticuerpos, que con frecuencia están vinculados, o conjugado, a una enzima, detecta proteína capa el fondo de un pozo en una placa de microtitulación. Cuando se expone a un sustrato, enzima anticuerpo causará un cambio de color, lo que indica la presencia de la proteína de interés en la muestra.
En este video, se explica la teoría detrás de cómo funcionan los ELISAs, incluyendo una discusión de tanto enlace con anticuerpos primarios y secundarios y la importancia de bloquear pasos. Teoría es seguida por la práctica, como el vídeo avanza a explicar el procedimiento paso a paso. Finalmente, las variaciones de la norma ELISA como el sándwich y Elisa competitiva son introducidas y reales aplicaciones de este método, tales como pruebas de embarazo de venta libre se explican.
Procedure
La ELISA o ensayo inmunoenzimático, es un método ampliamente utilizado para determinar la presencia o ausencia de una proteína objetivo específico.
Través de una serie de pasos vinculantes y lavado, un anticuerpo conjugado, o ligado, a una enzima reconoce una proteína de la blanco en la parte inferior de una placa de 96 pocillos. Cuando se añade a la muestra de sustrato, se produce una reacción enzimática, provocando un cambio de color permite la identificación y cuantificación de la proteína diana.
Antes de que discutimos cómo realizar un ELISA, vamos a familiarizarse con el equipo y reactivos que usted necesita.
El ajuste de una reacción de ELISA es típicamente un plato de fondo plano de 96 pozos. El fondo plano de los pozos ayudará a facilitar una distribución uniforme de la muestra experimental, así como sus captura y detección de los anticuerpos.
ELISA detecta la presencia de proteínas específicos en soluciones acuosas experimentales. Suero, orina y medios de cultivo celular son muestras experimentales comunes.
En un ELISA, el anticuerpo que se une directamente a la proteína Diana es el anticuerpo primario. Tiene alta afinidad, es decir, una alta capacidad para atar firmemente, para un epitopo - una región específica - de la proteína diana. El anticuerpo primario es generalmente sin etiqueta o no-conjugado.
Como se ha mencionado, sobre todo se unen a las proteínas de su destino a través de la alta afinidad de unión a un epitopo específico. Sin embargo, la muestra experimental puede contener trozos de células que expresan los sitios de Unión inespecíficos, sitios que se pueden unir a la región constante, o no-epitopo específica, de los anticuerpos de su detector.
Por lo tanto, la adición de un tampón de bloqueo es esencial en un ELISA para cubrir cualquier sitios de Unión inespecíficos en las muestras experimentales. De lo contrario puede tener reacciones enzimáticas que ocurren en pozos que no contienen proteína diana, dándole datos positivos falsos!
El anticuerpo secundario en un ELISA es el anticuerpo utilizado para reconocer el anticuerpo primario. Este anticuerpo es generalmente conjugado a una enzima. A veces el anticuerpo secundario tiene un nombre de funky. Por ejemplo, si el anticuerpo secundario, o levantado, en un burro para reconocer un anticuerpo primario en una cabra, el anticuerpo secundario se llamaría un anticuerpo de anti-cabra burro. Cuando se trata de anticuerpos secundarios de nombres, el nombre indica el organismo que produce el anticuerpo secundario, y el segundo nombre representa el organismo que produce el anticuerpo primario.
También será necesario un sustrato, que se une al sitio activo de la enzima ligada al anticuerpo secundario. La reacción química que ocurre durante esta reacción provoca un cambio de color en el sustrato lo contrario incoloro. Este supuesto ensayo colorimétrico permite la identificación y cuantificación de la presencia de la proteína diana.
La reacción enzimática continuará como hay sustrato disponible. Por lo tanto, después de un período de incubación breve, una solución, que causa un cambio de color indicar que la reacción se ha detenido de hecho, se añade a los pocillos.
Un lector de microplacas se utilizará para cuantificar la concentración de la proteína de interés en cada pozo mediante la lectura de la absorbancia, es decir, la cantidad de producto coloreado, en cada pozo. La absorbancia es proporcional a la cantidad de proteína de objetivo presente.
Ahora que tienes todo tu equipo listo, vamos a ejecutar un ELISA!
Para llevar a cabo un estándar o directo, ELISA, primero cubrir los pocillos de la placa de 96 pocillos con su proteína diana de interés diluido en tampón de recubrimiento. Placa de los controles positivos y negativos en este momento también.
Después de incubar la placa revestida de largo suficiente para dar el tiempo de la proteína totalmente adsorber o fijar, en la parte inferior de la placa, descarga de la solución de recubrimiento sobrante con un rápido movimiento de su muñeca.
Entonces bloquear cualquier señal no específica posible de enlace o fondo, incubando cada uno en solución amortiguadora de bloqueo.
Ahora la descarga de la solución amortiguadora de bloqueo y lavar los pocillos con una incubación breve temperatura en tampón fosfato salino, o PBS y 1% de BSA.
Mientras que los pozos son se enjuagaron con PBS, preparar las diluciones de una concentración conocida de la proteína diana para crear una curva estándar. La absorbancia de los pocillos de la curva estándar, que contienen concentraciones conocidas de la proteína diana, se utilizará para calcular la concentración de la proteína diana en sus pozos de muestra experimental basado en una comparación de la absorbancia de los pocillos de la muestra a la absorbancia de los pocillos de la curva estándar.
Ahora es el momento para agregar la detección o el anticuerpo primario.
Luego se incuba la placa, generalmente a temperatura ambiente, para permitir una cantidad suficiente de anticuerpos se unen a la proteína diana para su posterior detección y cuantificación de la proteína.
Después de la incubación, se quita exceso anticuerpo y brevemente se lavan los pocillos con PBS.
Luego se añade el anticuerpo secundario a la placa y la placa se incuba una vez más – por lo general en una plataforma giratoria, para permitir que el anticuerpo secundario enlazar. Pasos de lavado se repiten como antes.
A continuación, añadir el sustrato a la placa para ver que pozos contienen la proteína diana. Cubrir la placa para proteger a la reacción de la luz y entonces después de una breve incubación, detener la reacción con la solución de parada.
Por último, coloque el plato en el lector de microplacas para medir la absorbancia o la cantidad de solución coloreada, en cada pozo. Tendrá que seleccionar qué pozos al lector a analizar. Cuando se termina el instrumento de lectura de la placa, una lectura de la absorbancia para cada bien se mostrará.
Es importante tener en cuenta que cada kit de ELISA tiene un límite de detección. Es decir, se pueden determinar con precisión sólo concentraciones de proteínas por encima y por debajo de límites específicos. Concentraciones muy pequeñas de proteína son generalmente demasiado cerca de los niveles de fondo de tinción inespecífica, mientras que concentraciones muy altas pueden indicar que exceso proteínas o anticuerpos no fue correctamente arrastrados en esa muestra bien.
Así que ¿por qué podría realizar un ELISA? Echemos un vistazo a algunas aplicaciones comunes.
Probablemente el tipo más común de ELISA realizado es el ELISA.
En un sandwich ELISA, una placa de 96 pocillos está cubierta primero con un anticuerpo primario que reconoce la proteína diana de interés.
En este experimento, medios de cultivo de células de líneas celulares productoras de anticuerpos humanos, fueron plateadas por un sistema automatizado en placas de 96 pocillos recubiertos con un anticuerpo primario que reconoce anticuerpos humanos previamente.
Después de lavar lejos el exceso muestra con PBS, se añade un anticuerpo enzima-ligado del secundario, seguido por un sustrato colorimétrico.
La absorbancia se mide en la misma forma que un típico ELISA. Por ejemplo, en este experimento, este datos de ELISA se utiliza para determinar que líneas celulares de producen el anticuerpo humano con la afinidad más alta para – es la mejor capacidad con precisión a – su antígeno blanco.
La prueba de embarazo de venta libre es un tipo de sándwich ELISA.
Cuando la orina de la mujer potencialmente embarazada se agrega a la prueba, anticuerpos primarios enzima-ligado a la prueba unirá la hormona del embarazo hCG si está presente. Si la mujer está embarazada, se producirá una reacción sustrato-enyzme cuando los anticuerpos primarios son reconocidos por anticuerpos secundarios enlazados a sustrato en el sitio de prueba, y una línea de color aparecerá.
Otro tipo de ELISA es la prueba de ELISA competitivo, que puede utilizarse para detectar la presencia de anticuerpos.
Si los anticuerpos de interés están presentes en la muestra, se atan a la proteína diana en la parte inferior de la placa. Más tarde, cuando se agregan anticuerpos de detección de enzima-ligado a la placa, los anticuerpos enzima-ligados encontrará pocas a ninguna proteína atar; habrá sido "hacia fuera-compitieron" por los anticuerpos de interés en la muestra experimental.
En un ELISA competitivo, entonces, los pozos de color indican las muestras que realmente no contienen el anticuerpo de interés! Muestras de plasma paciente normalmente se ejecutan en un ELISA competitivo con el fin de determinar si para ciertos patógenos como el virus del VIH, los anticuerpos están presentes en la muestra.
Sólo ha visto la introducción de JoVE a realizar un ELISA. En este video repasamos: Qué es un ELISA y cómo funciona; Qué equipos y reactivos necesita realizar y ELISA; y algunas aplicaciones diferentes del análisis. Gracias por mirar y no olvide dejar su sustrato sobreexponer!
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