质粒纯化

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology
 

Summary

质粒纯化是将质粒DNA与基因组DNA、蛋白质、核糖体以及细菌细胞壁分离开的一种技术。质粒是小的环状双链DNA,用作特定DNA分子的载体。当质粒通过转化技术导入宿主细胞后,将被复制产生大量拷贝的DNA片段用于研究。

本短片讲述了常用的质粒纯化的逐步过程。质粒纯化包括三个基本步骤:细菌的培养,细菌的收集和裂解,质粒DNA的纯化。视频还解释了操作过程每一步中质粒在哪里会被发现,以及如何用分光光度计和电泳对质粒进行定量和纯度的分析。目前有多种质粒纯化的方法,可以根据所需质粒的产量,质粒的拷贝数目和细菌培养的体积来进行选择。

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JoVE Science Education Database. 细胞分子生物学中的基本方法. 质粒纯化. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

质粒是独立于染色体的环状DNA分子。在分子生物学中,他们被用作运送分子,或称载体,用于承载特定的DNA片段。利用细菌来复制质粒,可以大规模生产目的DNA。这个被研究人员用来从细菌中获得质粒的方法称为质粒纯化,将在本短片中得到讲解。

质粒纯化当然是指纯化质粒,但这具体是什么意思呢?要纯化质粒就是将质粒从细菌的染色体、蛋白质、细菌胞膜和细菌核糖体中分离出来。

尽管纯化质粒的试剂盒有很多种,但它们的基本原理都是一样的。首先,挑取细菌菌落在含正确抗生素的合适培养液中生长。由于质粒有编码抗生素抗性基因,只有那些含有该种质粒的细菌才能在这种培养液中生长。然后收获细菌,在高pH条件下进行裂解。接下来中和pH,加入盐,最后离心去除碎片和基因组DNA。

将中和的裂解物加到硅胶柱中。质粒DNA通过阴离子交换作用而被吸附到硅胶柱上。由于DNA是一种很强的阴离子,会通过阳离子盐桥和带负电的硅胶柱结合。而其他物质,例如蛋白质,会随着高盐缓冲液通过硅胶柱而不被吸附。最后,向硅胶柱中加入低盐缓冲液,破坏盐桥,从而将质粒DNA从硅胶柱中洗脱下来。

在操作中,应当穿戴合适的实验服,一次性手套和防护眼镜。

将携带目的质粒的细菌加入到含有合适抗生素的培养液中,在37摄氏度摇床上培养过夜。

第二天,离心收集细菌沉淀,弃去上清。然后用重悬缓冲液重悬细菌沉淀。

重悬之后,细菌被转移到一个较小的离心管中并加入裂解缓冲液。裂解缓冲液具有较高的pH值并含有去污剂,如十二烷基硫酸钠。它能够破坏细菌的细胞膜从而裂解细菌。刚加入裂解缓冲液时溶液会浑浊。混匀后将变得澄清。不要震荡混合液,否则可能会造成基因组DNA断裂,从而污染质粒DNA纯化。

然后加入中和缓冲液来中和碱性环境并降低pH。轻轻混匀,这样基因组DNA和与之结合的蛋白质会沉淀下来,而质粒DNA则会留在溶液中。这里同样也要避免震荡,防止基因组DNA污染质粒DNA。

离心混合物,使基因组DNA和蛋白质沉淀在底部。上清中则包含质粒DNA和可溶性蛋白。

将上清轻轻倒入或用移液枪转移到硅胶柱中,弃去沉淀。

接下来,用高盐缓冲液过柱,DNA仍将吸附在硅胶柱上。用高盐缓冲液反复洗涤硅胶柱,将去除掉核酸内切酶,核糖核酸,蛋白质,以及小分子量的杂质。过柱的高盐缓冲液应当丢弃。最后一步洗涤后,要确认硅胶柱完全干燥,没有任何缓冲液残留。此时,质粒DNA仍然结合在硅胶柱上。

使用无菌水或洗脱缓冲液来洗脱质粒DNA。得到的DNA可以被紧接着应用到很多方面。

纯化完成后,有许多方法可用来检验质粒的纯度。分光光度计可以通过比较在不同波长条件下的吸光度来测定质粒DNA的浓度。琼脂糖凝胶电泳也可用来分析质粒DNA的大小是否正确或者是否有杂质。这一步用来确认质粒没有被基因组DNA污染并且没有在细菌内被修饰。

对于不同的质粒大小、拷贝数、和培养体积,可相应改动该质粒纯化过程,包括使用不同的结合,清洗和洗脱设备。其中最主要的区分标准是质粒产量,它将质粒制备划分为微量提取,中量提取,大量提取和超量提取。

关于下游的应用,质粒纯化后通常会被用于一种叫做转染的技术。它是将质粒DNA转入到真核细胞当中。多数时候,转染的目的是利用报告蛋白来观察细胞或组织的结构,例如您这里看到的这些被标记的神经元。

有时,分别纯化的多个质粒会被转入到同一细菌当中,这些质粒编码几种酶,从而在细菌中再造形成一个完整的生物合成途径。最终结果是合成一种复杂的化合物,例如您这里看到的利用细胞生产的抗生素。

纯化的质粒也可能用来重新转化细菌,用于大量生产该质粒编码的蛋白质。这里您看到的是将细菌细胞破碎和裂解后,通过亲和层析来分离目的蛋白。然后结晶纯化的蛋白来进行结构分析。

您刚观看的是JoVE对质粒纯化的介绍。本短片中,我们讨论了该方法的基本原理,实验的逐步介绍,以及质粒制备的多种应用。我们一如既往地感谢您的观看。

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