质粒纯化

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Basic Biology collection to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

质粒纯化是将质粒DNA与基因组DNA、蛋白质、核糖体以及细菌细胞壁分离开的一种技术。质粒是小的环状双链DNA,用作特定DNA分子的载体。当质粒通过转化技术导入宿主细胞后,将被复制产生大量拷贝的DNA片段用于研究。

本短片讲述了常用的质粒纯化的逐步过程。质粒纯化包括三个基本步骤:细菌的培养,细菌的收集和裂解,质粒DNA的纯化。视频还解释了操作过程每一步中质粒在哪里会被发现,以及如何用分光光度计和电泳对质粒进行定量和纯度的分析。目前有多种质粒纯化的方法,可以根据所需质粒的产量,质粒的拷贝数目和细菌培养的体积来进行选择。

Cite this Video | Reprints and Permissions

JoVE Science Education Database. 细胞分子生物学中的基本方法. 质粒纯化. JoVE, Cambridge, MA, (2019).

质粒是独立于染色体的环状DNA分子。在分子生物学中,他们被用作运送分子,或称载体,用于承载特定的DNA片段。利用细菌来复制质粒,可以大规模生产目的DNA。这个被研究人员用来从细菌中获得质粒的方法称为质粒纯化,将在本短片中得到讲解。

质粒纯化当然是指纯化质粒,但这具体是什么意思呢?要纯化质粒就是将质粒从细菌的染色体、蛋白质、细菌胞膜和细菌核糖体中分离出来。

尽管纯化质粒的试剂盒有很多种,但它们的基本原理都是一样的。首先,挑取细菌菌落在含正确抗生素的合适培养液中生长。由于质粒有编码抗生素抗性基因,只有那些含有该种质粒的细菌才能在这种培养液中生长。然后收获细菌,在高pH条件下进行裂解。接下来中和pH,加入盐,最后离心去除碎片和基因组DNA。

将中和的裂解物加到硅胶柱中。质粒DNA通过阴离子交换作用而被吸附到硅胶柱上。由于DNA是一种很强的阴离子,会通过阳离子盐桥和带负电的硅胶柱结合。而其他物质,例如蛋白质,会随着高盐缓冲液通过硅胶柱而不被吸附。最后,向硅胶柱中加入低盐缓冲液,破坏盐桥,从而将质粒DNA从硅胶柱中洗脱下来。

在操作中,应当穿戴合适的实验服,一次性手套和防护眼镜。

将携带目的质粒的细菌加入到含有合适抗生素的培养液中,在37摄氏度摇床上培养过夜。

第二天,离心收集细菌沉淀,弃去上清。然后用重悬缓冲液重悬细菌沉淀。

重悬之后,细菌被转移到一个较小的离心管中并加入裂解缓冲液。裂解缓冲液具有较高的pH值并含有去污剂,如十二烷基硫酸钠。它能够破坏细菌的细胞膜从而裂解细菌。刚加入裂解缓冲液时溶液会浑浊。混匀后将变得澄清。不要震荡混合液,否则可能会造成基因组DNA断裂,从而污染质粒DNA纯化。

然后加入中和缓冲液来中和碱性环境并降低pH。轻轻混匀,这样基因组DNA和与之结合的蛋白质会沉淀下来,而质粒DNA则会留在溶液中。这里同样也要避免震荡,防止基因组DNA污染质粒DNA。

离心混合物,使基因组DNA和蛋白质沉淀在底部。上清中则包含质粒DNA和可溶性蛋白。

将上清轻轻倒入或用移液枪转移到硅胶柱中,弃去沉淀。

接下来,用高盐缓冲液过柱,DNA仍将吸附在硅胶柱上。用高盐缓冲液反复洗涤硅胶柱,将去除掉核酸内切酶,核糖核酸,蛋白质,以及小分子量的杂质。过柱的高盐缓冲液应当丢弃。最后一步洗涤后,要确认硅胶柱完全干燥,没有任何缓冲液残留。此时,质粒DNA仍然结合在硅胶柱上。

使用无菌水或洗脱缓冲液来洗脱质粒DNA。得到的DNA可以被紧接着应用到很多方面。

纯化完成后,有许多方法可用来检验质粒的纯度。分光光度计可以通过比较在不同波长条件下的吸光度来测定质粒DNA的浓度。琼脂糖凝胶电泳也可用来分析质粒DNA的大小是否正确或者是否有杂质。这一步用来确认质粒没有被基因组DNA污染并且没有在细菌内被修饰。

对于不同的质粒大小、拷贝数、和培养体积,可相应改动该质粒纯化过程,包括使用不同的结合,清洗和洗脱设备。其中最主要的区分标准是质粒产量,它将质粒制备划分为微量提取,中量提取,大量提取和超量提取。

关于下游的应用,质粒纯化后通常会被用于一种叫做转染的技术。它是将质粒DNA转入到真核细胞当中。多数时候,转染的目的是利用报告蛋白来观察细胞或组织的结构,例如您这里看到的这些被标记的神经元。

有时,分别纯化的多个质粒会被转入到同一细菌当中,这些质粒编码几种酶,从而在细菌中再造形成一个完整的生物合成途径。最终结果是合成一种复杂的化合物,例如您这里看到的利用细胞生产的抗生素。

纯化的质粒也可能用来重新转化细菌,用于大量生产该质粒编码的蛋白质。这里您看到的是将细菌细胞破碎和裂解后,通过亲和层析来分离目的蛋白。然后结晶纯化的蛋白来进行结构分析。

您刚观看的是JoVE对质粒纯化的介绍。本短片中,我们讨论了该方法的基本原理,实验的逐步介绍,以及质粒制备的多种应用。我们一如既往地感谢您的观看。

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

To watch full video, login or sign up!
If your institution is subscribed to the
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology
section, you can access that content off-site by login or signing up with your institutional email.
Sign In with Shibboleth

or

We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

RECOMMEND JoVE

Applications