Overview
Western Blot se utiliza para identificar la presencia de proteínas específicas en muestras separadas electroforéticamente. Después de separación mediante una técnica conocida como electroforesis en gel de poliacrilamida sodio dodecil sulfato, o SDS-PAGE, transferencia occidental se utiliza para mover las proteínas de un gel de poliacrilamida en un pedazo de membrana que atrapa las proteínas en sus respectivos localizaciones. A continuación, las membranas son sondeadas con los anticuerpos en un proceso llamado immunboblotting. Immunoblotting utiliza anticuerpos de proteínas y de unión de anticuerpos anticuerpos a través de sitios de reconocimiento específicos, proporcionando la alta especificidad necesaria para la identificación de una sola proteína. La detección de anticuerpos lleva a cabo utilizando sistemas de reportero que incluye el uso de enzimas. Las enzimas pueden fijarse al final de un anticuerpo y reaccionan con los sustratos para producir cambios de color o luz. Estas señales entonces pueden ser reflejadas y cuantificados mediante un proceso llamado densitometría ósea.
Este artículo de vídeo presenta un resumen de la técnica de inmunoblot describiendo transferencia western, el uso de la detección del anticuerpo y análisis de imágenes. Los pasos involucrados con la transferencia western como la Asamblea de los sandwich de transferencia y condiciones de transferencia se discuten en detalle, así como la teoría detrás de unión de anticuerpos y detección de los anticuerpos. La aplicación amplia de esta técnica se describe a través de varios ejemplos, incluyendo la detección de las interacciones proteína-proteína y la identificación de proteínas individuales dentro de complejos de la proteína.
Procedure
Western Blot es una técnica poderosa utilizada por muchos investigadores para identificar la presencia de proteínas específicas en una muestra separados electroforéticamente con anticuerpos.
Hay 3 etapas principales de esta técnica que son esenciales para un resultado de calidad: Electroblotting, Immunoblotting y detección. Antes de estas etapas, se debe realizar SDS-PAGE, en el que desnaturalizado las proteínas se separan por tamaño en un gel de poliacrilamida.
Electroblotting, también es conocido como el Western "transferencia" y requiere de una cinta de transferencia para celebrar juntos el "sándwich", así como un aparato para transferir proteínas de un gel de acrylimide a una membrana delgada. El sándwich de electroblotting consiste en el gel y una membrana especializada, intercalada entre dos pedazos de papel de filtro. Durante la transferencia, se utiliza un campo eléctrico, para mover las proteínas a través del gel, donde quedan atrapados en una membrana debido a las interacciones hidrofóbicas y cargadas.
Immunoblotting utiliza anticuerpos a la membrana de proteínas específicas de "sondeo". Los anticuerpos son grandes proteínas en forma de Y que contienen dos fragmentos, también conocido como regiones Fab, que se unen a otras proteínas. La región Fab define el epitope específico, o una porción específica de una proteína, a la que un anticuerpo se unirá.
Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos que reconocen un solo epítopo y son el tipo de anticuerpo preferido utilizado por immunoblotting debido a su especificidad. En cambio, los anticuerpos policlonales son una serie de diversos anticuerpos que se dirigen muchos epítopos del mismo antígeno – o proteína que un anticuerpo tiene especificidad. Anticuerpos monoclonales que reconocen un epítopo lineal son preferibles ya que asegura el epitopo puede encontrarse en una proteína desnaturalizada o lineal. Esto es importante porque muchos anticuerpos sólo reconocen epitopos conformacionales, que significa que reconocen las proteínas en sus 3D nativo del estado solamente.
Además de fragmentos Fab, anticuerpos contienen una región Fc, que es el animal que produce el anticuerpo específica. En immunoblotting, esta región se utiliza principalmente como el epitopo de un anticuerpo secundario – un anticuerpo que reconoce el primer anticuerpo que ha enlazado a la proteína que se está tratando de detectar.
Para producir una señal observable, anticuerpos a menudo están vinculados, a través de su región Fc, a una enzima reporter, como con peroxidasa alcalina fosfatasa o rábano picante. Estas enzimas reportero producen señales al reaccionar con los substratos para causar cambios de color o producir cambios de luz.
Estos cambios se pueden cuantificar entonces mediante densitometría. La densitometría es la técnica utilizada para medir la densidad de una banda de proteína usando software de análisis de imagen para calcular la densidad de cada banda. Las bandas se puede directamente cuantificado utilizando patrones de referencia o internamente controlado utilizando una muestra de control.
Para una exitosa transferencia Western, el gel es equilibrado en tampón de transferencia primero durante 15 minutos. La membrana también debe ser equilibrada según las instrucciones del fabricante.
A continuación, el sándwich de transferencia gel es cuidadosamente preparado en tampón de transferencia para evitar burbujas de quedar atrapado dentro del sistema. Burbujas atrapadas en el sándwich pueden ser forzadas hacia fuera rodando sobre ellos con una pipeta pequeña. Incluso pequeñas burbujas pueden interrumpir a la transferencia de las proteínas causando a transferencia incompleta como puede verse en las partes bajas de esta membrana.
Una vez montado, tampón de transferencia adicional se vierte en la cámara de transferencia y se ejecuta en 20-30 mA durante 2-3 horas. Tampón de transferencia contiene metanol, que realza el atascamiento de las proteínas a la membrana.
Una vez terminada la transferencia se desmonta la cinta y la calidad de la transferencia puede comprobarse mediante una tinción de proteínas no específicas como Ponceau S. Esto ofrece una detección rápida y reversible de bandas de proteínas.
El primer paso de immunoblotting es cubrir las áreas restantes de la membrana con una solución diluida de proteínas. Este paso se llama bloqueo y realiza, con el fin de bloquear la membrana y reducir el atascamiento no específico del anticuerpo a la membrana. Por lo general, la solución de bloqueo consiste en albúmina de suero bovino o leche en polvo descremada disuelta en una solución salina tamponada. Este paso generalmente se realiza durante 1 hora hasta toda la noche en un agitador.
El siguiente paso es incubar la membrana con el anticuerpo primario diluido en la solución de bloqueo. Este paso puede tomar desde 30 minutos hasta toda la noche y se debe realizar con agitación suave.
Luego, la membrana se enjuaga cuidadosamente para reducir la tinción de fondo inespecífica y el anticuerpo secundario es agregado en solución amortiguadora de bloqueo a la membrana. Después de una corta incubación, la membrana se enjuaga otra vez a fondo.
Anticuerpos secundarios son perceptibles gracias a las enzimas de reportero que están atadas a ellos. Además el sustrato correcto, cambios colorimétricos o quimioluminiscencia pueden ser reflejadas y luego medición con técnicas de densitometría. Además, la escala de proteína proporciona una valiosa referencia que se puede estimar basado en cuánto ha migrado en el gel en relación con los marcadores de tamaño en la escala de tamaño lineal de cada proteína. Observar el tamaño de las proteínas detectadas mediante immunoblotting es una buena manera de verificar que el anticuerpo reconoce la proteína correcta y si es un monómero o unas múltiples copias de la proteína que están siendo vistos.
Hay miles de anticuerpos primarios disponibles en el mercado, que permite la detección y cuantificación de proteínas específicas dentro de una muestra. Aquí un investigador utiliza un anticuerpo de HIF-1α para medir la cantidad de este factor de transcripción sensible de oxígeno en cultivos de células para detectar hipoxia. También utilizaron un anticuerpo para beta-actina para actuar como un control de carga. Como se puede ver, las células cultivadas en condiciones de oxígeno normales producen mucho menos HIF-1 que los cultivados en condiciones de poco oxígeno.
La combinación de la electroforesis del gel del 2D y el immunoblotting puede proporcionar información valiosa en la presencia de complejos de la proteína. Aquí, las muestras fueron primero dirigidas por tamaño complejo de proteína y luego desnaturalizado para cada proteína individual en el complejo podría ser separado por su tamaño individual. Anticuerpos para los tres diferentes proteínas muestran tres únicos complejos que contienen diferentes cantidades de estas proteínas con cada complejo dispuesto en una línea vertical. La izquierda más columna contiene beta-2 y MCP-21, así como otra proteína no demostrado por estos marcadores. La columna central muestra un complejo que contiene todas las 3 proteínas, y la columna derecha contiene sólo beta-2 y MCP-21.
Immunoblotting también puede utilizarse para visualizar las interacciones proteína-proteína. Esto se realiza por primera vez transferencia de proteínas de un gel a una membrana de nitrocelulosa y luego sondeo la membrana con proteínas adicionales. Immunoblotting se utiliza para detectar el if las proteínas añadidas complejadas con cualquiera de las proteínas que fueron inmovilizadas en la membrana.
Sólo has visto video de Zeus en immunoblotting. Ahora debería entender cómo transferir las proteínas a una membrana, sonda de membrana con anticuerpos y detectar la señal. ¡Como siempre, gracias por ver!
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