Réactions de ligature d'ADN

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Summary

En biologie moléculaire, la ligature fait référence au raccrochement de deux fragments d'ADN à travers la formation d'une liaison phosphodiester. Un enzyme connu sous le nom de ligase catalyse la réaction de ligature. Dans la cellule, les ligases réparent les simples ou doubles brins cassés, ceci a lieu lors de la réplication de l'ADN. Au laboratoire, l'ADN ligase est utilisé pendant le clonage moléculaire pour relier les fragments d'ADN d'inserts avec les vecteurs – porteurs de molécules d'ADN qui vont répliquer les fragments cibles dans les organismes hôtes.

Cette vidéo fournit une introduction à la ligature d'ADN. Le principe de base de ligature est décrit ainsi que la procédure étape par étape de mise en place d'une réaction de ligature généralisée. Les aspects critiques des réactions de ligature sont discutés, tels que comment la longueur d'un surplomb à extrémité cohésive affecte la température de réaction et comment le rapport d'insert et de vecteur d'ADN doit être ajusté pour éviter l'auto-ligature. Les outils moléculaires qui aident les ligatures tels que le fragment de Klenow et la phosphatase alcaline de crevette (SAP) sont mentionnés. Les utilisations tels que les ligatures de proximité et l'ajout de lieurs aux fragments pour le séquençage sont aussi présentés.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Méthodes de base en biologie cellulaire et moléculaire. Réactions de ligature d'ADN. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

La ligature peut être définie comme l'acte du raccordement. En biologie, le terme fait référence à une réaction enzymatique qui lie deux biomolécules via une liaison covalente. Cette vidéo décrit l'application de la ligature d'ADN dans le domaine de la recherche en biologie moléculaire.

Dans la cellule, l'ADN ligase est une enzyme qui identifie et casse les joints dans l'ADN en catalysant la formation des liaisons phosphodiester entre les groupes 3'-hydroxyle et 5'-phosphate de la colonne vertébrale de l'ADN. La ligature apparait comme une part du processus habituel de la cellule, comme la réplication de l'ADN, pour réparer les cassures de simple ou double brin d'ADN.

En laboratoire, l'ADN ligase est utilisée régulièrement dans le clonage moléculaire – ce processus lie les fragments d'ADN digérés par l'endonucléase, ou inserts, avec un vecteur digéré par l'endonucléase, tel que le plasmide, de manière à ce que le fragment puisse être introduit dans les cellules hôtes et ensuite être répliqué.

La digestion d'endonucléase inclut l'utilisation d'endonucléases de restriction, ou enzymes de restriction, qui créent des entailles à des etirements spécifiques de l'ADN.

Ces entailles peuvent ressembler aux coupures du simple brin produisant les surplombs 3' et 5', appelées extrémités cohésives, ou aux coupures de double brin sans surplombs, appelées extrémités franches. La ligature à extrémités cohésives est avantageuse, car les paires de base complémentaires en surplomb stabilisent la réaction. Du fait que les ligatures à extrémités franches n'ont pas de paire de base complémentaire, la ligature est moins efficace et il est plus difficile pour l'enzyme de lier les extrémités. Les extrémités cohésives et les extremites franches ne peuvent pas, en conditions normales, etres liées l’une à l’autre.

Cependant, le fragment de Klenow - le produit de l'ADN polymérase 1 digéré par de la subtilisine - peut convertir des extrémités cohésives en extrémités franches. Klenow possède l'activité exonucléase de 3' à 5' (3'->5') qui mâche les surplombs 3', et l'activité polymérase (de 5' à 3') qui émousse les surplombs 5' en étendant l'extrémité 3' du brin complémentaire.

Lorsque le but est d'insérer un gène dans un plasmide, la fermeture de l'ADN vecteur, appelé auto-ligature, est un résultat indésirable commun pour une réaction de ligature. Le traitement de l'ADN vecteur par phosphatase alkaline, après digestion, élimine les phosphates 5' sur les deux extrémités et empêche ce résultat indésirable.

Comme nous l'avons mentionné précédemment, les ADNs vecteur et ADNs d'insert sont digérés par les endonucléases avant le début d'une ligature. Après la purification sur gel des vecteur et inserts digérés, les concentrations d'ADN sont mesurées par spectrophotometre, pour déterminer la concentration des vecteurs et inserts purifiés.

A partir de cette concentration, le nombre de molécules d'insert ou de vecteur dans 1 µl peut être déterminé sur la base du poids moléculaire moyen pour une paire de base d'ADN et le nombre de paires de base dans chaque fragment. Sur la base de la concentration moléculaire de vecteur et d'insert calculée, un ratio 3 pour 1 d'insert pour vecteur est calculé, afin de déterminer le volume de vecteur et d'insert utilisé dans la réaction. Ce ratio de 3 insert pour 1 vecteur d'ADN est désirable, car il augmente la probabilité qu'un insert soit ligaturé à un vecteur, plutot qu'un vecteur soit ligaturé à lui-même.

Maintenant que nous avons déterminé la quantité de vecteur et d'insert d'ADN à utiliser dans la réaction, procédons à la mise en place de la réaction de ligature sur glace. L'orde d'ajout des composants de la réaction à votre microtube est le suivant: eau stérile en quantité suffisante pour atteindre un volume final de 10 µl (dans notre cas nous allons utiliser 4 µl), 1 µl de tampon de ligature 10X, 1 µl d'ATP à 10 mM, 1 µl de vecteur et 3 µl d'insert d'ADN, comme calculé, et enfin 1 µl d'ADN ligase. Bien mélanger et centrifuger la réaction et l’incuber à la température appropriée.

La température et la durée de réaction vont être impactées par le type de ligature (soit cohésive, soit franche) que vous allez réaliser. Par exemple, une ligature à extrémités cohésives avec un surplomb de six paires de bases peut être menée proche de la température ambiante pendant 1 hr, du fait que les extrémités complémentaires stabilisent la liaison des fragments. Les surplombs courts ou ligatures à extrémités franches devraient être menés entre 14 et 20°C pendant la nuit.

Maintenant que nous avons étudié comment mettre en place une réaction de ligature, intéressons-nous à quelques applications de cette procédure.

Les ligatures peuvent être utilisées pour insérer directement les fragments amplifiés par PCR dans des plasmides linéarisés. Ici vous voyez un chercheur prenant un échantillon de cerveau de souris congelé, isolant l'ADN génomique de celui-ci, puis le soumettant au bisulfite PCR, qui est une méthode basée sur la PCR pour détecter l'ADN méthylé. Les produits de la PCR sont ensuite directement ligaturés dans le plasmide pour créer une bibliothèque de gènes, qui sont méthylés dans cette région particulière du cerveau.

Les ligatures peuvent être utilisées pour attacher des lieurs oligonucléotidiques, qui contiennent les sites d'attaches pour les amorces PCR, afin de purifier les fragments d'ADN. En travaillant avec des échantillons de tumeur, les scientifiques peuvent utiliser cette approche pour séquencer l'ADN génomique tumoral, avec l'espoir d'identifier les mutations causant la tumeur.

Dans cette vidéo, la ligature est réalisée sur de l'ADN isolé à partir de cellules fixées au formaldéhyde puis traitées avec un enzyme de restriction et Klenow en présence de biotine, qui est alors utilisé pour baisser l'ADN ligaturé. Cet ADN est amplifié par PCR et les produits sont séquencés afin d'identifier les interactions de chromatine à différentes échelles, comme demontré.

Vous en savez maintenant plus sur l'ADN ligase, sur une variété de principes impliqués dans la mise en place de la ligature au laboratoire, les problèmes potentiels et leurs correctifs, ainsi que plusieurs utilisations de la ligature pour la recherche en biologie moléculaire. Merci pour votre attention.

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