La digestion d'Enzyme de Restriction

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology
 

Summary

Les enzymes de restriction ou endonucléases reconnaissent et coupent l'ADN en une séquence spécifique. Ces enzymes sont produits naturellement chez les bactéries comme défense contre les bactériophages – virus qui infectent les bactéries. Les enzymes de restriction bactérielles coupent l'ADN du bactériophage invasif tout en laissant l'ADN génomique bactérien sain et sauf grâce à l'addition de groupes méthyles.

Cette vidéo explique les principes de base des enzymes de restriction incluant: comment les enzymes de restriction sont appelés et les types de sites de reconnaissance et surplombs. Une procédure pas à pas généralisée est fournie pour montrer comment mettre en place une digestion de restriction, ce qui inclus les composants nécessaires, l'ordre dans lequel le mélange doit être fait, et les températures et temps typiques d'incubation. L'importance des enzymes de restriction inactivés pour prévenir l'activité star est également mentionnée. Des conseils pour réaliser des digestions avec de multiples enzymes et l'utilisation de contrôles dans les réactions de digestion sont aussi fournis.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Méthodes de base en biologie cellulaire et moléculaire. La digestion d'Enzyme de Restriction. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Les enzymes de restriction, ou endonucléases de restriction, sont utilisées dans une variété d’applications en biologie moléculaire. Ces enzymes reconnaissent et adhèrent à une séquence spécifique d'ADN, appelée site de restriction. La vidéo que vous allez regarder fournit quelques informations contextuelles sur ces molécules miraculeuses et montre comment mettre en place la digestion d'une enzyme de restriction.

Mais d’où proviennent ces enzymes de restriction? Ces enzymes sont l’adaptation d'une bactérie qui agit comme un mécanisme de défense contre les virus bactériophages. Grâce à l'addition de groupes méthyles aux sites d'enzymes de restriction de l'ADN bactériel, les enzymes de restriction reconnaissent et coupent uniquement l'ADN phagique, prévenant ainsi l'infection.

Les enzymes de restriction ont des noms assez étranges. Par exemple, HindIII, Notl, EcoRI and BamHI. Les trois premières lettres du nom d'un enzyme de restriction font référence à l'organisme duquel il a été isolé. Par exemple, l'enzyme de restriction EcoRI fut isolé de E.coli. La quatrième lettre, si nécessaire, fait référence à la bactérie souche de laquelle l'enzyme a été isolé. Le chiffre romain indique si c'est le premier, le deuxième ou le troisième enzyme isolé depuis cet organisme particulier.

Les enzymes de restriction reconnaissent une séquence de nucléotides, généralement quatre à huit paires de bases de long, appelée site de reconnaissance. Au niveau de certains nucléotides spécifiques à l'intérieur de la séquence, l'enzyme va rompre la liaison phosphodiester dans le squelette de l'ADN. Les sites de reconnaissance sont généralement palindromiques, ce qui signifie que la succession des nucléotides est lue de manière identique en avant et en arrière. Lorsque le palindrome est trouvé sur des brins complémentaires de la molécule d'ADN, il est appelé inverted-repeat palindrome.

Une fois que l'ADN est fendu, les enzymes de restriction peuvent engendrer différents types d'extrémités: les extrémités cohésives et les extrémités franches. Les extrémités cohésives laissent 3' et 5' en surplomb alors que les extrémités franches ne laissent pas de surplomb. Le type d'extrémité dicte comment le fragment d'ADN isolé par la digestion de l'enzyme de restriction sera recombiné avec d'autres fragments d'ADN dans un procédé appelé ligature.

La digestion d'une enzyme de restriction doit être soigneusement planifiée. Une réaction de digestion est typiquement composée de: l'eau désionisée, l'ADN qui va être coupé, le tampon spécifique à l'enzyme que vous utiliserez, et parfois une protéine appelée albumine de sérum bovin ou BSA. La BSA stabilisera la réaction en empêchant l'enzyme de coller aux côtés du récipient dans lequel a lieu la digestion. Chaque enzyme de restriction peut potentiellement avoir des conditions de tampon et des températures d'incubation différentes, et besoin de BSA. Les fournisseurs d'enzymes de restriction ont des ressources qui peuvent être consultées pour obtenir toutes les informations nécessaires.

Pour commencer la mise en place de la digestion, retirez l'enzyme de restriction du congélateur ou du réfrigérateur. Gardez l'enzyme de restriction dans la glace ou dans un récipient thermorésistant pour être certain qu'il y ait une activité optimale pour les futures réactions. Dans un microtube, les composants de la réaction doivent être ajoutés dans l'ordre suivant. D'abord, un volume d'eau stérile sans nucléase qui donnera lieu à un volume final réactionnel de 20μL. Ensuite le tampon de l'enzyme de restriction 10x, de la BSA si nécessaire, jusqu'à 1μg d'ADN, et 2 à 10 unités d'enzymes. Les unités sont définies comme la quantité d'enzyme requise pour produire une digestion complète de 1μg d'ADN de contrôle, en 60 minutes, à 37°C, dans un volume réactionnel de 50μL. Après cela, mélangez en tournoyant, puis passez brievement dans la microcentrifugeuse à 12,000g afin de collecter le contenu dans le fond du tube. Ensuite incubez à une température optimale pour votre enzyme de restriction, généralement 37°C dans un bloc de chauffage pour 1 à 4 heures.

Une fois que votre digestion est terminée, il est bon d'incuber le mélange réactionnel à 65°C pour chauffer les enzymes de restriction non activés. Tandis que les enzymes de restriction coupent spécifiquement au site la plupart du temps, des temps d'incubation prolongés peuvent conduire à une activité star, qui coupe aux sites qui sont similaires, mais distincts de leurs sites typiques de digestion.

Après l'inactivation, l'ADN doit être exécuté sur un gel d'agarose pour s'assurer que la digestion est reussie.

Voici quelques pistes utiles pour exécuter votre digestion et assurer sa réussite.

Vous pouvez parfois vous retrouver dans une situation, où plusieurs enzymes doivent être utilisés pour générer un fragment spécifique d'ADN. Dans ce cas, vous devrez vérifier que les conditions du tampon et les températures d'incubation sont compatibles pour les deux enzymes. Si c'est le cas, vous pouvez alors réaliser une double digestion et les deux enzymes vont couper dans la même réaction. Cependant, vous aurez parfois des incompatibilités dans les conditions de réaction entre les deux enzymes. Dans ce cas il faut utiliser les enzymes successivement. Par exemple, la digestion peut d'abord être réalisée avec une enzyme, avant d’alterer la composition du tampon dans le but d’etre optimisée pour un second enzyme. Pour surmonter l'incompatibilité des tampons et effectuer une digestion séquentielle, vous pouvez aussi purifier l'ADN apres la première digestion, et réaliser la seconde digestion par la suite.

L'utilisation de contrôles est un bon moyen de comprendre les raisons d’un mauvais deroulement de la digestion. Par exemple, un contrôle sans enzyme vous permettra de tester l'intégrité de l'échantillon d'ADN et de déterminer si une activité d'exonucléase est présente. L'utilisation d'ADN de contrôle avec des sites de restriction connus permet de tester l'activité de l'enzyme.

Maintenant que nous avons vus comment les digestions sont effectuées, interessons-nous aux différentes utilisations des enzymes de restriction.

Les enzymes de restriction peuvent être utilisés pour le diagnostic, en vue d'identifier des échantillons particuliers. En lançant une digestion dans une puce spécialisée, puis en plaçant cette puce dans une machine appelée Bioanalyseur, les chercheurs peuvent examiner les tailles des fragments d'ADN produits par la digestion, en vue de déterminer l'authenticité d’échantillons de poissons. Les différents modèles de bandes du même gène d'une espèce donnée, ou dans ce cas de différentes espèces, sont appelés polymorphisme de longueur des fragments de restriction.

Les enzymes de restriction peuvent aussi être utilisés en sous-clonage, pour isoler un fragment d'ADN d'un plasmide et l'insérer dans un autre, de sorte que le fragment désiré puisse être répliqué en utilisant des bactéries.

En utilisant la réaction en chaine de polymérase, ou PCR, pour introduire des sites de restriction dans les genes à des endroits bien précis, les enzymes de restriction peuvent être utilisés pour déterminer la présence de différences de nucléotides simples dans des formes alternées du même gène, ou allèle. Ces polymorphismes de nucléotides simples, ou SNPs, sont difficiles à détecter avec la PCR et l'électrophorèse sur gel seuls. Avec l'introduction de sites de restriction à l'intérieur de SNP, une simple digestion permet de distinguer les allèles.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur les enzymes de restriction. Vous avez appris d'où ces enzymes proviennent, visionné quelques bases sur leur fonctionnement , vu comment réaliser une digestion, et appris comment les enzymes de restriction peuvent être utilisés en biologie moléculaire. Comme toujours, merci pour votre attention!

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