分子克隆

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Summary

分子克隆是将重组DNA插入到载体中的一套方法,载体作为DNA分子的携带者,将在宿主体内复制重组DNA片段。 而DNA片段,可能是从原核或真核生物中分离得到一个基因。分离得到目的片段或称插入片段后,将其与载体用限制性酶切割并进行纯化。纯化后的片段通过一种叫做“连接”的技术连在一起。催化该连接反应的酶被称为连接酶。

本短片将按顺序介绍构成整个分子克隆操作过程的主要方法。并将讨论分子克隆技术的重要方面,例如分子克隆方案的必要性和如何追踪转化的菌落。也将提及其检测步骤,如用限制性酶切和测序来判断纯化的质粒中是否含有目的片段。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 细胞分子生物学中的基本方法. 分子克隆. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

分子克隆技术是一组用于插入到一个复制的载体,如质粒或病毒载体的重组DNA从原核或真核源的技术。克隆是指无数份的DNA片段,如一个基因。在这段视频中,您将了解分子克隆,如何设置的程序,不同的应用这种技术的不同步骤。

至少在两个重要的DNA分子是必需的,在克隆之前开始。首先,也是最重要的,你需要你要克隆的DNA片段插入,否则被称为。其能够使来自原核细胞,真核细胞,死的生物体,或者它可以在实验室中人工创建。通过利用分子克隆技术,我们可以了解更多关于特定基因的功能。

其次,你需要一个载体。向量是作为分子生物学中的一个工具,使更多的副本或从产生一种蛋白质的质粒DNA目标基因。质粒的载体的一个例子,并且是圆形的,额外的染色体,DNA是由细菌复制。

的质粒通常具有多克隆位点,或MCS,此区域包含不同的限制性内切核酸酶也称为限制酶的识别位点。不同的插入可以掺入到质粒的技术称为结扎。的质粒载体还含有复制起点,这使得它能够在细菌中复制。此外,该质粒具有抗生素的基因。如果细菌包括质粒,将生存的媒体,包含抗生素。这允许选择已成功转化的细菌。

被克隆的插入片段和载体导入宿主细胞的生物体,分子克隆中使用的最常见的是大肠杆菌。大肠杆菌生长迅速,被广泛使用,并有许多不同的商业化生产的克隆载体。真核生物中,等,酵母也可以被用来作为宿主的组织结构为载体的anisms。

一般分子克隆程序的第一个步骤是,以获得所需的插入,可以是来自于从任何类型的细胞中的DNA或mRNA。的最佳载体,它的宿主生物体,然后选择基于他们类型的插入,并最终会用它做什么。甲聚合酶链反应,或基于PCR的方法经常被用来复制的插入。

然后通过使用一系列酶促反应,插入和摘要结合在一起,并导入宿主有机体的质量复制。复制的载体是从细菌中纯化,酶切后,在凝胶上分析。凝胶纯化片段送往测序验证插入所需DNA片段。

让我们更详细一点看看如何进行分子克隆。在开始之前,你将要规划出你的克隆策略之前,作出任何形式的克隆尝试在板凳上。为例如,任何给定的质粒载体,将提供有限数量的限制性酶切位点,将通过多个克隆网站插入。你需要选择酶切位点都没有发现在你的插入,这样你就没有劈开它。你可能会留下一个情况下,你是被迫加入钝端片段,有一个悬。如果是这样,那么使用的Klenow片段设立一个钝端结扎,可能是唯一的选择,插入到您所需的矢量。了解各种分子克隆工具,在您的处置,以及与前仔细战略开始克隆能产生巨大的节省时间。

几乎任何类型的细胞或组织样品通过简单的提取技术可以分离出DNA分子克隆的来源。一旦分离,PCR可用于扩增插入。

一旦插入物都被放大,并且通过限制性内切酶消化该载体,也称为限制性核酸内切酶。

消化后,插入片段和载体可以在凝胶上运行,并纯化,这个过程被称为凝胶纯化。对于矢量,这一步将有助于净化线性质粒完整无缺的质粒,这往往显示为高分子量涂抹凝胶。

凝胶纯化消化后,插入连接或接合质粒,通过DNA连接酶的酶称为。

一般来说,它始终是一个好主意,结扎,从而使插入载体的比例为3比1,从而确保只有少量的向量自结扎。结扎后已成立于冰上孵育14-25˚C从1小时至过夜。

接着,执行变换引入到宿主,将复制的质粒载体。

随着转化细菌接种在琼脂平板上,与抗生素和孵育在37℃过夜。 ,因为plasimid含有抗生素水库成功转型基因艾斯坦斯,会产生细菌菌落琼脂平板上生长时,在场的抗生素。单个菌落可以被拾起转化板,管编号放入液体生长介质,投入摇床扩张。一个小体积的液体培养物被添加到一个编号的琼脂平板上,而其余的培养上移动到质粒纯化。整个质粒纯化过程中被保持的编号方案,它表示从最终将被纯化的质粒的细菌菌落的身份。

的样本纯化的质粒,然后用限制性​​内切酶切割。的摘要,然后加载并运行在凝胶上,以检查插入物的存在下,将验证转化的细菌菌落的质粒含有插入片段,而不是自我连接的质粒。验证已插入含有质粒转化的细菌,扩大弗思ER质粒净化。测序是用来执行的最终验证步骤,以确认您感兴趣的基因已被克隆。

可用于分子克隆,从而产生几乎无限数量的应用。例如,当一个mRNA模板逆转录形成的cDNA或互补的DNA,通过一种酶称为反转录酶,然后用PCR来扩增的cDNA的分子克隆的cDNA文库可用于创建 - 所有的图书馆由一个给定的信元类型的基因表达。

也可以采用采取了一系列的基因或基因簇的一个菌株中,重组到质粒转化在另一个应变,因此可以重新产生一个复杂的分子的整个生物合成途径的分子克隆。

通过分子克隆技术,可以产生在一个特殊的细菌菌株培养时,使用一个容易出错的聚合酶表达的目标质粒突变体库在一定温度下。的突变可以被其特征在于,测序。突变基因转化的细菌,然后可以测试不同的药物或化学物质已经发展到具有耐药性的细菌菌落。

由于分子克隆可以被纳入DNA质粒,报告基因,一个共同的报告基因绿色荧光蛋白或GFP,当暴露在紫外线下时,发出绿色荧光。报告基因也可以插入显示甲病毒感染的蚊子及传递细胞。

您刚看了JoVEs,视频分子克隆。您现在应该了解分子克隆技术如何工作以及如何技术可以应用于分子生物学。与往常一样,感谢收看!

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