Clonación molecular

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Summary

Clonación molecular es un conjunto de métodos que se utilizan para introducir ADN recombinante en un vector - un portador de las moléculas de ADN que se replican fragmentos de ADN recombinante en los organismos huésped. El fragmento de ADN, que puede ser un gen, puede ser aislado de un espécimen de procariota o eucariota. Tras aislamiento del fragmento de interés, o insertar, el vector y el inserto deben ser corte con enzimas de restricción y purificados. Las piezas purificadas se unen entre sí, aunque una técnica llamada ligadura. La enzima que cataliza la reacción de la ligadura es conocida como ligasa.

Este video explica los principales métodos que se combinan, en tándem, por el procedimiento de clonación molecular en general. Se discuten los aspectos críticos de la clonación molecular, como la necesidad de la estrategia de clonación molecular y cómo hacer un seguimiento de colonias de bacterias transformadas. También se mencionan los pasos de verificación, como comprobación de plásmido purificado para la presencia del inserto con resúmenes de la restricción y la secuenciación.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Métodos Básicos en Biología Celular y Molecular. Clonación molecular. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Clonación molecular es un conjunto de técnicas utilizadas para introducir ADN recombinante de una fuente de procariota o eucariota en un vehículo de replicación como plásmidos o vectores virales. La clonación se refiere a hacer numerosas copias de un fragmento de ADN de interés, como un gen. En este video usted aprenderá sobre los diferentes pasos de la clonación molecular, cómo se establece el procedimiento, y diferentes aplicaciones de esta técnica.

Al menos dos importantes moléculas de ADN se requieren antes de que comience la clonación. En primer lugar y lo más importante, necesita el fragmento de ADN que vas a clonar, conocido como el relleno. Puede provenir de una célula procariota, eucariotas, un organismo extinto, o puede ser creado artificialmente en el laboratorio. Mediante el uso de clonación molecular podemos aprender más acerca de la función de un gen en particular.

En segundo lugar, usted necesita un vector. Un vector es la DNA del plasmid utilizado como herramienta en biología molecular para hacer más copias del o producir una proteína de un gen determinado. Plásmidos son un ejemplo de un vector y son circulares, extra cromosómico DNA que se replica por las bacterias.

Un plásmido tiene típicamente un sitio múltiple de clonación o MCS, esta zona contiene sitios de reconocimiento para diferentes endonucleasas de restricción también conocido como enzimas de restricción. Diversos partes movibles pueden ser incorporados en el plásmido por una técnica llamada ligadura. El vector plásmido también contiene un origen de replicación, que le permite replicarse en bacterias. Además, el plásmido tiene un gen de antibiótico. Si las bacterias incorporan el plásmido, sobrevivirá en los medios de comunicación que contiene el antibiótico. Esto permite la selección de bacterias que se han transformado con éxito.

El inserto y el vector son clonados en un organismo de la célula huésped, el más común utilizado en la clonación molecular es e. coli. E. coli crece rápidamente, es ampliamente disponible y tiene numerosos vectores de clonación diferentes producidos comercialmente. Eucariotas, como la levadura puede usarse como organismos de acogida para vectores.

El primer paso en el procedimiento de clonación molecular general es obtener la inserción deseada, que puede derivarse de DNA o mRNA de cualquier tipo de célula. El vector óptimo y su organismo de acogida están entonces elegido basado en tipo de relleno y, en definitiva, qué se hará con él. Una reacción en cadena de polimerasa, o PCR basado en método a menudo se utiliza para replicar el inserto.

Luego mediante el uso de una serie de reacciones enzimáticas, el insertar digest se unieron e introducida en el organismo del anfitrión para la replicación masiva. Vectores replicadas son purificados de bacterias y después de la digestión de la restricción, analizado en un gel. Fragmentos purificados de gel son enviados más tarde para que la secuencia comprobar que el margen es el fragmento de ADN deseado.

Vamos a haber un poco más detallado vistazo en clonación molecular cómo se lleva a cabo. Antes de empezar, tendrá que planificar su estrategia de clonación, antes de hacer cualquier clonación intento en el Banco. Por ejemplo, cualquier vector plásmido determinado, le proporcionará un número finito de sitios de restricción para incorporar el relleno a través del sitio de clonación múltiple. Usted necesitará elegir sitios de restricción que no se encuentran en su dispositivo para que usted no lo hiende. Usted podría dejarse con una situación que se ven obligados a unirse a un fragmento del extremo romo con uno que tiene un saliente. Caso, utilizando el fragmento klenow para configurar una ligadura del extremo romo podría ser su única opción para obtener el inserto en el vector deseado. Comprensión de la diversas molecular clonación herramientas a su disposición, así como dar con una estrategia cuidadosa antes de comenzar la clonación puede ser un ahorro de tiempo inmenso.

La fuente de ADN para clonación molecular puede ser aislada de casi cualquier tipo de célula o tejido muestra a través de técnicas de extracción simple. Una vez aislado, PCR puede utilizarse para amplificar la inserción.

Una vez que el inserto es amplificado junto con el vector son digeridos por enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas de restricción.

Una vez digerido, el inserto y el vector pueden correr en un gel y purificadas por un proceso llamado purificación del gel. Con respecto al vector, este paso le ayudará a purificar el plásmido linearizado de plásmido sin cortar, que tiende a aparecer como un borrón de transferencia de alto peso molecular en un gel.

Después de los resúmenes de la purificación del gel, el prospecto es ligado o unido a los plásmidos, mediante una enzima llamada ADN ligasa.

En términos generales, siempre es una buena idea configurar trompas, por lo que la proporción de insertar a vector es 3 a 1, que asegura que sólo una pequeña cantidad del vector de uno mismo-se liga. Una vez que la ligadura se ha establecido en el hielo, se incuba en cualquier lugar de 14-25 ° c de 1 hora hasta toda la noche.

A continuación, transformación se realiza para introducir el vector plásmido en el host que se replicarlo.

Siguientes bacterias de transformación son revestidas en placas de agar con antibióticos y se incubó durante la noche a 37° C. Porque el plasimid contiene un gen de resistencia a los antibióticos, transformación exitosa producirá colonias bacterianas cuando se cultivan en placas de agar en la presencia de antibióticos. Colonias individuales se pueden recoger la placa transformada, en medios de cultivo líquidos en los tubos numerados y poner en un incubador de agitación para la expansión. Un pequeño volumen de cultivo líquido se agrega a una placa de agar numeradas, mientras que el resto de la cultura pasa a purificación del plásmido. El esquema de numeración que indica la identidad de colonias bacterianas que los plásmidos eventualmente serán purificada se mantiene durante todo el proceso de purificación del plásmido.

Un ejemplo de plásmido purificado se corta con enzimas de restricción. El Resumen entonces se carga y ejecuta en el gel con el fin de comprobar la presencia del inserto, que verificará que la Colonia bacteriana fue transformada con un plásmido que contiene un inserto y plásmido no auto ligado. Las bacterias verificadas que han sido transformadas con un plásmido que contiene el inserto, se amplían para la posterior purificación del plásmido. La secuencia se utiliza como un paso de verificación final para confirmar que ha sido clonado el gen de interés.

Clonación molecular puede ser utilizada para un número casi ilimitado de aplicaciones. Por ejemplo, cuando una plantilla del mRNA es revés transcrito a cDNA de forma, o ADN complementario, por una enzima llamada transcriptasa reversa y PCR permite amplificar cDNA, clonación molecular puede utilizarse para crear una biblioteca del cDNA-una biblioteca de todos los genes expresada por un tipo celular determinado.

La clonación molecular se puede también emplear para tomar una serie de genes, o racimo del gene de una cepa bacteriana, reorganizar en plásmidos que se transforman en otra cepa, por lo que puede crearse un todo camino biosintético para producir una molécula compleja.

A través de la clonación molecular, puede generarse una biblioteca mutante expresando un plásmido de destino en una cepa bacteriana especial que utiliza una polimerasa propensa a error cuando se cultivan en ciertas temperaturas. Las mutaciones pueden caracterizarse por la secuencia. Las bacterias transformadas con genes mutantes se pueden probar entonces con diferentes drogas o productos químicos para ver que colonias de bacterias han evolucionado para tener resistencia a los medicamentos.

Gracias a la clonación molecular, genes reporteros pueden ser incorporados en plásmidos de ADN, un gen reportero común es proteína verde fluorescente o GFP, que emite una fluorescencia verde cuando se expone a la luz UV. Un gen reportero puede también insertarse en un alphavirus para demostrar infección en los mosquitos y transmisibilidad en las células.

Sólo ha visto video de JoVEs en la clonación molecular. Ahora debería entender cómo moleculares clonación obras y cómo se puede utilizar la técnica de biología molecular. ¡Como siempre, gracias por ver!

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