Overview
Larvas y embriones de drosophila melanogaster son fáciles de manipular y desarrollar rápidamente por mecanismos que son análogos a otros organismos, incluyendo los mamíferos. Por estas razones, muchos investigadores utilizan embriones de moscas y larvas para responder preguntas en diversos campos que van desde comportamiento para Biología del desarrollo. Antes de la experimentación, sin embargo, los embriones y larvas deben primero ser recogidas.
Este video primero demostrará cómo "tazas de puesta de huevos" se utilizan para recolectar embriones de Drosophila en placas de agar. A continuación se describirá la cosecha y dechorionation de embriones. A continuación, el video demostrará cómo identificar y manipular de Drosophila en una de las tres etapas larvales que siguen la etapa de embrión. Finalmente, se proporcionan ejemplos de algunas de las maneras en que las larvas y embriones de mosca se utilizan en investigación biológica.
Procedure
Larvas y embriones de drosophila melanogaster son fáciles de manipular y su desarrollo es guiado por los mecanismos que existen en otros organismos, incluyendo los mamíferos. Aprender a cosechar y preparar los embriones y larvas es un paso preliminar en muchos procesos experimentales de comportamiento a la biología del desarrollo. Este video cubre los métodos estándar para la recolección y cosecha de Drosophila embriones y larvas, procedimientos esenciales en el uso de este organismo modelo.
El estudio del embrión de Drosophila ha proporcionado gran información sobre la manera que genes regulan el desarrollo, desde el ARNm que se expresa en un gradiente en el ovocito, a los genes que forman el plan de cuerpo segmentado de anterior a posterior. Algunos de estos genes, como los genes de homeobox están muy conservados entre este insectos y mamíferos.
La abundante naturaleza de Drosophila embriones les permite soportar la exposición a entornos y productos químicos, que las hace muy práctico para estudiar.
Después de la fecundación una mosca hembra puede poner hasta 100 embriones por día, que eclosionan en larvas, después de 12-15 horas.
Con el fin de manipular embriones de Drosophila , primero deben ser recogidos.
Embriones se recogen en cámaras de desove referidos a menudo como "tazas de puesta de huevos".
Para montar la Copa puesta, empujar primero los agujeros o cortar parte de un contenedor y cubrirla con material poroso para permitir la ventilación. Entonces obtener una placa de agar jugo de manzana o uva, raya con la pasta de levadura y rayar las placas en el centro. La presencia de levadura pasta inducirá la puesta de huevos.
Rápidamente añadir moscas a la cámara de desove, invertir la cámara para que la placa está en la parte inferior y permita que incubar. Después del tiempo de incubación deseado invertir la cámara del huevo y golpearlo en la mesa un par de veces. Las moscas caen al fondo y son brevemente desorientadas. Reemplazar rápidamente la vieja placa de agar con la placa fresca en capas con la pasta de levadura. Para adquirir los embriones más cambian las placas cada 1-3 horas.
Las placas tendrán cientos de embriones, especialmente cerca de los arañazos y la levadura.
20 moscas de cada sexo deben producir embriones de 100 a 200 por hora. Ahora los embriones pueden ser cosechados.
Las herramientas necesarias para la recolección de embriones son un filtro o tamiz, que puede variar mucho en tamaño y complejidad, un pincel y agua destilada.
En primer lugar, afloje los embriones sumergiendo la placa con agua destilada, cepillar suavemente la superficie con un pincel. A continuación, filtrar líquido vertiendo la mezcla en el colador. Enjuague los embriones con agua.
Es a menudo sigue dechorionation, la eliminación de la dura membrana externa del embrión, o corion.
Dechorionation puede hacerse manualmente a través de una disección del embrión fuera de la vaina coriónica. Alternativamente, se pueden colocar embriones en blanqueador de 50%. Toma 2-10 minutos para el corion a disolver, como lo señala la desaparición de los apéndices dorsales. Enjuague con agua destilada para asegurarse de que el embrión desnudo esté dañada por lejía. Dechorionation es un requisito previo a las técnicas de microinyección como la proyección de imagen de células vivas.
Ahora que han conseguido un sentido de la biología del embrión, recolección y cosecha, pasemos a la siguiente etapa en el ciclo de vida de Drosophila : larvas.
Las larvas de Drosophila tienen tres etapas de "instar" o muda. El primer instar dura un día, el segundo otro día y los tercera dos días más. Larvas de primer y segundo estadio se encuentran en la comida del frasco de 1-3 días después de la configuración de una cruz. En el 4to día, larvas de tercer estadio migran hacia arriba, o "pasear" los lados del envase, donde será en última instancia forman capullos llamados pupas.
Las larvas se suelen utilizar para la experimentación debido a sus discos imaginales. Los discos imaginales son órganos parcialmente desarrollados que son conocidos por ser partes enteras de la mosca adulta. Por ejemplo, un disco imaginal ojo se convertirá en un ojo adulto, discos antenales se convertirá en antenas y discos imaginal del ala se convertirán en alas. El estudio de discos imaginales ha llevado a importantes descubrimientos en Drosophila, como el papel de los genes homeobox en formación.
Colección de larvas es más simple que la colección de embriones, ya que requiere a la transferencia de las moscas en caja especial.
Cada larva puede quitarse con pinzas o una espátula. Al recoger un gran número de larvas etapa temprana se puede emplear un método de recogida alternativos utilizando una solución de sacarosa, que es más denso que las larvas y les hace flotar.
Añadir solución de sacarosa al frasco, que boyas de larvas en la parte superior. Desalojar la comida colocando el frasco en un rotor. Luego retirar las larvas con un cepillo o pipeta y cosecha para los experimentos.
Ahora que hemos cubierto recogida y recolección técnicas de embriones y larvas, ahora vamos a ven cómo aplicar a la experimentación.
Puesto que son móviles, las larvas de Drosophila pueden utilizarse para experimentos conductuales.
Aquí se puede apreciar un "ensayo rastreros", que se utiliza para evaluar el comportamiento locomotor de Drosophila bajo condiciones específicas. Las medidas de ensayo arrastre la distancia la larva viaja, con el fin de observar los efectos de un fármaco sobre la función motora. Las larvas recolectadas se sumergen en una solución de sacarosa drogado que se prevé que interfieren con la motilidad.
Microinyección es un procedimiento para crear genéticamente modificados moscas de la fruta, conocidas como mutantes transgénicos, mediante la inserción de material genético modificado para requisitos particulares en la forma de un plásmido de ADN circular.
Estos embriones son dechorionated físicamente rodando sobre cinta de doble cara para no dañan productos químicos. Los embriones entonces inyectó de plásmidos que codifican proteínas, como la tubulina, fusionado con proteínas fluorescentes reportero, como GFP. Entonces pueden realizar experimentos para visualizar procesos celulares como la mitosis de establecido líneas moscas transgénicas.
Embriones permite visualizar la presencia de transcritos mediante hibridación in situ fluorescente.
En este experimento, embriones enteros se observan la presencia de una transcripción de ARNm deseado mediante microscopía de fluorescencia. Los embriones se fijan mediante una solución bifásica dechorionates y por lo tanto prepara el embrión para la tinción. Los embriones desnudos se encuentran en la capa inferior. Después de la tinción inmunofluorescente, se aprecia la presencia de la proteína deseada utilizando microscopía de fluorescencia.
Sólo ha visto embrión de JoVE y recolección de la larva y preparación video. Repasamos la colección, recolección y preparación de embriones y larvas y algunas aplicaciones importantes aplicados a los primeros organismos de la etapa. ¡Gracias por ver!
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