Mantenimiento de la levadura

Biology I

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Summary

Investigación realizada en la levadura Saccharomyces cerevisiae ha mejorado significativamente nuestra comprensión de phenomona celular importante tales como la regulación del ciclo celular, el envejecimiento y muerte celular. Las muchas ventajas de trabajar con S. cerevisiae son los hechos que son económicos crecer en el laboratorio y que muchas cepas de listo para su uso están comercialmente disponibles. Sin embargo, el mantenimiento de este organismo es fundamental para experimentos exitosos.

Este video le proporcionará una visión general de cómo crecer y mantener la S. cerevisiae en el laboratorio. Se explican los conceptos básicos requeridos para el control de la proliferación de una población de levaduras, tales como generar una curva de crecimiento usando un espectrofotómetro. Este video también muestra las técnicas prácticas para mantener a S. cerevisiae en el laboratorio, incluyendo la preparación de los medios de comunicación, cómo iniciar una nueva cultura de células de levadura y cómo almacenar esas culturas. Por último, el video muestra algunas de las formas que estas técnicas de mantenimiento y manipulación se aplican en la investigación científica.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Elementos esenciales de la biología I: levadura, Drosophila y C. elegans . Mantenimiento de la levadura. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Los descubrimientos importantes de la regulación del ciclo celular, actividad de la telomerasa y autofagia en Saccharomyces cerevisiae, han demostrado que esta levadura especie un organismo modelo valioso para la investigación. Levadura son fáciles de crecer y plásmidos de levadura y cepas están comercialmente disponibles. A pesar de los requerimientos relativamente baratos para el cultivo de levadura, mantenimiento de este organismo es fundamental para los experimentos exitosos. Este video te dará un interior mira en cómo crecer cultivos de células de levadura y mantener las cepas de S. cerevisiae en laboratorios.

En biología, las curvas de crecimiento representan el cambio en la población de la célula durante un período de tiempo. En la levadura, la curva de crecimiento se genera mediante la representación de la densidad óptica, o &quo; OD &quo;, de cultivo celular a 600 nm en el eje y y tiempo en el eje x. Densidad óptica o &quo; absorbancia &quo; es la relación logarítmica entre la intensidad de luz que entra a la suspensión de células de levadura a la intensidad que pasa a través de él. La do a una determinada longitud de onda de la luz se mide mediante un espectrofotómetro.

Cuando trabaje con levadura, la curva de crecimiento de la cepa de levadura debe generarse tomando medidas OD en diferentes intervalos de tiempo. La curva de crecimiento de la levadura se divide en tres fases principales: fase logarítmica y estacionarios de lag,. Fase lag, las células se aclimate al ambiente y crecen en tamaño pero no se están dividiendo. En fase de registro, las células están dividiendo activamente lo que conduce a la duplicación de la célula. Una vez que se agotan los nutrientes disponibles, células de levadura entran en fase estacionaria, donde frena la división celular y la población celular permanece constante.

Usando la curva de crecimiento, el tiempo de duplicación de la cepa puede calcularse con la siguiente ecuación: OD1 y OD2 representan las mediciones de densidad óptica, y T1 y T2 están el tiempo entre mediciones. El tiempo de duplicación se define como el tiempo requerido para una población de la célula para duplicar su número de celular. Calcular entre dos valores del OD de la fase del registro, por ejemplo, entre los valores de 0,2 y 0,5 como se muestra aquí. Tipo salvaje levadura debe dar un valor de tiempo de duplicación de aproximadamente 90 minutos.

Conocer el tiempo de duplicación es beneficioso ya que le permitirá planificar sus experimentos durante todo el día.

Ahora que hemos cubierto los bulones de la curva de crecimiento de la levadura, vamos a avanzar en el laboratorio y hacer algunas manos en preparación para cultivar las células de levadura. Los principales componentes de medios de cultivo ricos — también conocido como alimento de la levadura - son: levadura extracto, peptona y una fuente de azúcar. Extracto de levadura contiene contenido de la celda de levadura, excepto la pared celular y proporciona aminoácidos, vitaminas, carbohidratos y otros nutrientes necesarios para el crecimiento. Peptona se deriva de la leche o la carne de los animales y es la fuente principal de aminoácidos en los medios de la levadura. Se agrega una fuente de azúcar, por lo general glucosa, ya que proporciona energía a las células de crecimiento.

Después de disolver el extracto de levadura y peptona en agua, esterilizar la mezcla utilizando un autoclave. Para hacer las placas de los medios de comunicación de la levadura, añadir agar a los líquidos medios de comunicación y vierta la mezcla en placas, lo que le permite solidificar a temperatura ambiente. Estas placas se pueden usar cuando rayas cepas crecer colonias de levadura.

¿Ahora que ya tenemos todos nuestros medios preparados, Cómo crecemos las culturas de estas criaturas desde cero? Primero y principal, asegúrese de que todo instrumento, soluciones y medios de comunicación son estériles.

A continuación, obtener una placa a raya a las células de levadura. ¡No ese tipo de rayas! Rayas es el proceso de propagación de cultivos de levadura líquida en placa de agar con un instrumento estéril, como puedes ver aquí. Alrededor de la &quo; rayas &quo; forman colonias individuales, que se derivan de una célula de levadura única, que puede ser recogida, con el fin de obtener una población pura genética de las células de levadura. Una vez que las placas son veteadas, invertir la placa y coloque en una incubadora de 30 ° C durante 2 a 3 días. Esta es la temperatura óptima para el crecimiento de la levadura.

Una vez que han formado colonias, inocular las células de levadura en un pequeño volumen de medio de crecimiento. Sembrar aquí significa escoger una sola Colonia y presentación a los medios de comunicación al mezclar brevemente. Incubar el cultivo en 30 ° C agitador o rotador durante 48 horas.

Para crecer más grandes cultivos de células, compruebe primero la OD600 de la cultura 2 día levadura usando un espectrofotómetro. Hacer las diluciones apropiadas para que el OD inicial es aproximadamente 0.1-0.2. Después de diluir las células, colocar el matraz en una coctelera de 30 ° C y crecen las células hasta el OD deseada.

La siguiente lección importante después de aprender a crecer S. cerevisiae es cómo almacenar para uso futuro. Levadura en las placas puede almacenarse a 4 ° C 3 meses. Sin embargo, si usted quiere crecer un cultivo fresco, asegúrese de que usted vuelva a raya las células en un plato fresco primero antes de inocular.

Para almacenar las existencias de levadura cepas por largos períodos, alícuotas las células en crioviales que contiene glicerol. Células pueden guardarse luego a-80 ° C, donde puede permanecer hasta varios años.

Ahora que eres un pro cuando se trata de crecimiento de las células de levadura, echemos un vistazo a cómo podemos aplicar estas técnicas esenciales en la investigación científica. Las células en la fase estacionaria se pueden utilizar para el estudio de genes que regulan la inestabilidad del ADN genómica durante el envejecimiento. Este video clip muestra la colección de células de un cultivo de tres días de edad. Se platean en medios selectivos que impide que las células de levadura normal de crecimiento. Sólo las células que han adquirido una mutación pueden formar colonias en estas placas. El número de colonias en las placas es proporcional al nivel de inestabilidad genómica en la cultura.

Otro ejemplo de estudio de envejecimiento es mediante el análisis de la duración cronológica de las células de levadura. Envejecimiento cronológico denota pérdida de la viabilidad celular durante un período de tiempo y puede ser estudiada por la creciente cultura líquido como se muestra aquí. En este video, el científico está cargando varias culturas sobre la especificación para generar las curvas de crecimiento, lo que ayudará a determinar la viabilidad celular.

Las células de levadura del tipo salvaje en fase logarítmica representan las células sanas, normales y pueden utilizarse para el estudio de organelos de eucariotas, como los ribosomas. En este video, se puede ver que la carga de la célula de lisado de células recogido en fase logarítmica a un gradiente de sacarosa. A continuación, las células son giradas a los ribosomas de sedimento y un monitor de absorbancia se utiliza para generar el perfil del ribosoma.

Sólo ha visto la introducción de Zeus a la cría y mantenimiento de Saccharomyces cerevisiae. En este video repasamos la curva de crecimiento de levadura, demostró cómo hacer crecer cultivos de células y le enseñó a mantener cepas de levadura. Gracias por mirar y no te olvides de recomendar este video a un brote.

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