Summary
Overview
Eine der vielen Vorteile der Benutzung von Hefe als Modellsystem ist dass große Mengen von Biomakromolekülen, einschließlich der Nukleinsäuren (DNA und RNA), von kultivierten Zellen aufgereinigt werden können.
Dieses Video zeigt die notwenigen Schritte, um Nukleinsäureaufreinigungen durchzuführen. Wir fangen an, indem wir zeigen wie die Hefezellen kultiviert, geerntet und lysiert werden, welche wichtige erste Schritte sind, die alle Aufreinigungsprotokolle von Makromolekülen gemein haben. Danach erläutern wir zwei Aufreinigungsverfahren um Nukleinsäuren zu separieren: Bindung an eine Säule und Phasentrennung. Zusätzlich zeigen wir verschiedenen Wege wie diese Verfahren in einem Labor angewendet werden, einschließlich der Präparation von Nukleinsäuren für molekularbiologische Anwendungen wie zum Beispiel dem PCR, Southern Blotting, der Quantifizierung der Genexpression als Antwort auf sich verändernde Umweltbedingungen, und der Aufreinigung von großen Mengen rekombinanter Proteine.
Procedure
Heute zeigen wir euch wie man Nukleinsäuren aus Saccharomyces cerevisiae, auch als Bäckerhefe bekannt, aufreinigt. Nukleinsäuren können sowohl DNA als auch RNA sein. Dieses Video zeigt wie man diese Moleküle von Hefezellen durch Phasentrennung oder Chromatographie trennt.
Auch wenn es viele verschiedene Methoden gibt, um Nukleinsäuren aus Hefe aufzureinigen, sind die ersten Schritte meist gleich.
Hefezellen werden propagiert, indem man eine einzelne Kolonie von einer Platte auswählt, und YPD Medium damit impft. Diese Mischung sollte über Nacht bei 30°C in einem schüttelnden oder rotierenden Inkubator kultiviert werden.
Die Hefezellen sollte man in der Mitte der exponentiellen Wachstumsphase ernten, um die Ausbeute zu optimieren. Hefe in der exponentiellen Wachstumsphase hat normalerweise eine optische Dichte, oder OD, von 0.5-1 gemessen bei 600 nm. Wenn die Zellen die angemessene optische Dichte erreicht haben, zentrifugiert man sie in ein Pellet, und resuspendiert dieses Pellet in Lysierungspuffer, so dass die Zellen aufgebrochen werden.
Eine der schwierigsten Aspekte bei der Aufreinigung von Nukleinsäuren von Hefe ist das Zerstören der robusten Zellwand. Die Zellwände werden durch eine Kombination aus enzymatischen und physischen Verfahren zerstört. Die Zerstörung der Zellwand führt zu der Bildung von sphäroiden Zellen, oder Sphäroplasten, die durch Standardlysierungsverfahren lysiert werden können.
Sphäroplasten werden normalerweise mit chemischen Detergenzien, wie zum Beispiel Natriumlaurylsulfat, kurz SDS, lysiert, welches die zellulären Membranen zerstört. Die Zellen können auch homogenisiert werden. Dafür fügt man Glaskugeln zu den Zellen hinzu und vermischt sie auf dem Vortexmischer. Die Zellwände können auch mit ultrahochfrequentem Schall, zum Beispiel von einem Sonikator, zerstört werden, um den Lysierungsprozess zu vereinfachen.
Wie wir schon erwähnt haben, sind die ersten Schritte des Kultivierens, Erntens und Lysierens der Hefezellen ähnlich zwischen den verschiedenen Aufreinigungsverfahren. Wenn die Zellen jedoch ersteinmal lysiert sind, können verschiedene Methoden verwendet werden, um Nukleinsäuren aufzureinigen. Nukleinsäuren können durch die Bindung an eine Säule oder durch Phasentrennung aufgereinigt werden.
DNA und RNA werden am besten durch die Bindung an einer Silica-Säule aufgereinigt. Nukleinsäuren binden die Säule durch Anionen-Austausch und können von der Säule eluiert werden, nachdem sie von den anderen zellulären Bestandteilen getrennt worden sind.
Die Phasentrennung beruht auf dem Prinzip das Lösungen mit unterschiedlichen Eigenschaften benutzt werden können, um Proteine oder Nukleinsäuren, abhängig von ihrer Löslichkeit, aufzureinigen oder zu konzentrieren. Die Zugabe von Chloroform zu dem Zellgemisch führt zu der Bildung von zwei verschiedenen Phasen: der wässrigen Phase und der organischen Phase. Die organische Phase enthält die Proteine und die wässrige Phase die Nukleinsäuren. Die DNA kann dann durch die Zugabe von Ethanol aus der wässrigen Phase ausgefällt werden.
Nukleinsäuren können von Hefe durch die Verwendung eines Säulen-Bindungsprotokolls getrennt werden. Zuerst werden die Hefezellen kultiviert und durch Zentrifugierung geerntet.
Der Überstand wird dann entfernt und verworfen, und das Pellet wir in einem Enzym-haltigen Puffer mit dem Vortexmischer vermischt und inkubiert bis die Zellwände verdaut sind. Die Zellwand-Verdauung und Sphäroplast Bildung kann mittels Mikroskopie geprüft werden, wenn man die Enzymbehandlung optimiert. Nach dem Zellwand-Verdau wird der Lysispuffer zu den Zellen hinzu gegeben und das Gemisch wird mit dem Vortex vermischt.
Die lysierten Zellen werden dann zentrifugiert, um die Überreste von der Mischung zu trennen, wobei die DNA, kleine Partikel und lösliche Proteine in dem Überstand zurück bleiben. Der Überstand wird dann auf eine Silica-Säule aufgetragen, an welche sich die Nukleinsäuren nach der Zentrifugation binden und bei welcher auch die Mehrheit der löslichen Unreinheiten entfernt werden.
Die Waschschritte werden mit Ethanol oder einem Puffer mit hoher Salzkonzentration ausgeführt, um die restlichen Unreinheiten von den gebundenen Nukleinsäuren zu entfernen. Letztlich wird die DNA oder RNA mit Wasser oder einem Puffer mit niedriger Salzkonzentration eluiert. Man sollte sicherstellen einen Puffer oder Wasser zu benutzen ohne DNase und Rnase.
Nukleinsäuren, die von Hefe isoliert worden sind, haben abhängig von dem experimentellen Ziel verschiedene Anwendungen. Die DNA, welche von der Hefe isoliert worden ist, kann für mehrere molekularbiologische Methoden angewendet werden, einschließlich des PCRs, dem Southern Blot, oder dem Verdau mit Restriktionsenzymen.
Änderungen in der Genexpression können durch ein Verfahren das Microarray Analyse genannt wird, identifiziert werden, wofür man Genarrays wie diesen hier benutzt.
Wenn es zwei verschiedene Hefekulturen gibt, wobei eine Wasserstoffperoxid ausgesetz wurde und die andere nicht, kann die mRNA von diesen Kulturen isoliert und dann auf Microarraychips hybridisiert werden. Die Chips werden dann analysiert und die sich durch oxidativen Stress verändernden Gene können identifiziert werden.
In diesem Video benutzen Forscher einen Roboter, um eine Bibliothek von genom-weiten Hefemutanten vorzubereiten, welche benutzt werden, um die Funktion von spezifischen Genen zu untersuchen. Durch die Einfügung von speziell hergestellten Sequenzen, welche man genetische Barcodes nennt, kann genomische DNA von ca. 4000-6000 Mutanten Stämmen gleichzeitig isoliert und mit Microarray oder durch Sequenzieren analysiert werden. Durch die relative Menge der Barcode Sequenzen kann die Fitness der einzelnen Mutanten bei verschiedenen experimentellen Bedingungen bestimmt werden.
Das war die Videoeinführung in die Aufreinigung von Nukleinsäuren aus Hefen von JoVE. Ihr solltet nun die grundlegenden Aspekte verstehen, wie man Nukleinsäuren aufreinigt, einschließlich der Hefezelllysierung, und der verschiedenen Extraktions-und Aufreinigungsverfahren. Wie immer, danke für eure Aufmerksamkeit.
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