秀丽隐杆线虫的实验室基本培养

Biology I

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Summary

秀丽隐杆线虫作为一种模式生物,曾经并且依然在研究发育,遗传,分子甚至生理现象等不同领域上发挥着重大作用。为了有效利用线虫的全部潜能,尤为关键的是正确小心地对该功能强大的模式生物的基本培养。本短片中,您将学习到线虫培养所需的基本饲养容器和食物,如何用挑针正确操作和处理线虫,如何冻存和复苏线虫。在视频的最后我们将了解一些调整饲养容器,食物和处理线虫的实际应用。

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JoVE Science Education Database. 模式生物I:酵母,果蝇和秀丽线虫. 秀丽隐杆线虫的实验室基本培养. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

正确地培养和保存秀丽隐杆线虫对实验成功至关重要。

它们所需的饲养空间小,饲养成本低,繁殖力高并易于操作。但容易培养并不意味着它们对科研用处不大。实际上众所周知,Sydney Brenner将线虫称之为“大自然送给科学的礼物”,线虫自1974年被发现以来,就出现在众多诺贝尔奖获得者的成名实验中。

本短片中我们将演示实验室里线虫的基本培养方法。包括:线虫的培养容器和喂食,操作以及冻融。

在野生环境里,线虫存在于土壤中,以腐烂植物为食。在实验室里,保证线虫的生长状态良好非常重要,因此我们要用非常特别的饲养方法。

线虫依据实验要求可在16,20或25摄氏度生长。可在固体也可在液体培养基中培养,但无论哪种培养条件,线虫都以OP50为食,OP50是世界各地线虫实验室专用于线虫培养的标准大肠杆菌株系。

在25摄氏度下生长时,线虫完成其生命周期的时间较16摄氏度时要快2.1倍。 生长周期越快意味着线虫成熟越快,产卵越多,食物消耗也越大。 当线虫食物匮乏或其生长过密时,它们就进入一种称之为多尔阶段的幼虫期。 多尔幼虫是一种停止衰老的逆境耐受状态。

使用固体培养基时,线虫在用线虫生长培养基,也称NGM培养基制备的琼脂板上生长。在制板的前一天,挑取OP50单克隆接种于LB培养液,37度震荡过夜。 为配制固体培养基,称量适量的培养基组分并混合到含去离子水的锥形瓶中。 高压灭菌十五分钟以上后,置于55度水浴冷却琼脂。当琼脂冷却到55度时,这时应该空手可轻松握住玻璃瓶,再使用无菌技术加入药物或抗生素,摇瓶混匀。 用移液管将熔化的NGM培养基加入到平板,直到占总体积的2/3。将新制备的平板置于工作台风干过夜。

次日上午,将OP50菌液3500g离心10分钟后用LB培养液重悬到10倍应用浓度。 然后在每个平板中央加入菌液铺开。不要让枪头接触NGM培养基表面,也不要让菌液接触平板内壁。 将平板置于工作台过夜晾干。平板干燥后,置于紫外灯下灭菌。然后平板就可用于培养线虫了。

单个线虫的操作需要用到叫作线虫挑针的工具。这些挑针由含90%铂和10%铱的30号金属丝制作而成。不同的研究人员依其喜好会采用含不同金属成分的工具。 制作挑针时,先将巴斯德管尖折断到合适长度。 剪约3-4厘米的金属丝,伸入0.5厘米到巴斯德管尖内。 用布氏喷灯将金属丝封入玻璃中。伸出玻璃的金属丝长度约为3-3.5厘米,也可依据个人喜好调整长度。 用硬物将金属丝末端压平,然后将压平的部分弯曲成勺状。最后抛光边缘以避免在挑取线虫过程中碰伤线虫或琼脂。 挑取线虫时,先将金属丝在火焰上灭菌。用针尖从NGM培养板上挑取粘厚的OP50菌块,操作中小心不要刺破或刮花琼脂表面。 利用解剖镜观察,轻轻将线虫舀到平端粘稠的针尖上粘住。 当线虫粘到挑针上后,立即将针尖轻轻靠到新平板表面上并在菌层上滑动。 线虫会爬离挑针。线虫不宜在挑针在太久否则会干死。

线虫能长期保存而无任何不良影响是其成为热门的研究模式生物的原因之一。 首先用0.5毫升M9缓冲液洗涤新鲜饥饿的幼虫。轻轻晃动以分离幼虫和成虫,然后将其转移到离心管或冻存管中。再加入等体积的30%甘油到M9缓冲液。最后将小管置于密封盒中于-80度保存。 复苏线虫时,从-80度冰箱取出小管,室温解冻直至冻存物完全化开。将液体吸取到含OP50菌层的NGM平板上,20度孵育。2-3天后,转移10-15只成虫到新的平板,让其繁殖一代。收集子代来检测表型是否正确。

我们刚才观看了如何在实验室保存线虫。 再让我们看看如何根据实验需要相应变动饲养和操作条件。

诺贝尔奖成果RNA干扰能让研究人员沉默线虫的任何一个基因以确定其功能。 首先,准备长有表达目的基因双链RNA大肠杆菌的平板,在平板上培养的线虫会以这些大肠杆菌为食,可以诱导线虫的RNA干扰。 然后将第四幼虫期的线虫转移到RNA干扰平板上让其产卵。 收集处于目的发育阶段的子代,检测其表型。 由于我们半数的基因和线虫的基因相似。许多在这些基因研究上的成果可以应用于人类疾病的治疗。

线虫的生命周期短,因而是一种特别适合作为研究衰老的模型。 首先让雌雄同体的成虫在NGM培养基上产卵来建立一个同步的线虫群。让成虫产卵6-8个小时后从平板上挑走。 当线虫长到目的发育期时将它们转移到新的NGM 培养板上,培养板含有防止细菌污染的氨苄和防止繁殖的5-氟脱氧尿苷。 从这个时间点开始每2-3天观察成虫,直到所有线虫死亡。每次将死虫从平板上挑走并记录下活虫和死虫的数目。 分析在遗传或环境受损情况下的寿命可以让我们对衰老过程有重要的认识。

激光的应用使得在活体线虫中实施轴索显微外科术或个体轴突切割成为可能,从而了解神经细胞是如何再生的。 由于线虫无法保持静止。将含线虫的微珠液滴在10%的琼脂糖垫片上。加上盖玻片。 微珠能增加垫片和盖玻片的摩擦系数,从而有效将线虫固定在原位。 这样准备的玻片就可用于轴索显微外科术了。 在显微镜下将神经元细胞调至视野中央。用脚踏板发射激光。优化好的激光束能将神经元切割而不伤及邻近的其他组织。对每个线虫切割出尽可能 多的轴突。 切割完后小心将琼脂糖垫片从玻片上拿开, 让线虫在一块有菌层的NGM培养板上20度复苏。 轴索显微外科术后的8到48小时内,可评估神经元的再生情况。在切割的远端部分,神经元形成墩状。但是在近端部分,神经元再生形成伸长的神经突起。

您刚观看的是JoVE 关于秀丽隐杆线虫基本培养的短片。 本短片中我们重温了线虫的饲养喂食,操作以及线虫的冻存和复苏。 我们还简单了解了线虫作为功能强大的研究工具的一些应用。 尽管线虫和哺乳动物很多方面不同。但它们在基因构成方面还是相似的。 由于线虫的培养容易,操作简单,使得它们成为一种重要的模式生物用于了解哺乳动物生物学和疾病方面的知识。感谢您的观看。

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