线虫RNA干扰的简介

Biology I

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Summary

RNA干扰是一种应用广泛,将外源双链RNA引入到生物体内从而导致目的基因的表达下调的技术。在线虫中应用RNA干扰技术极为简便高效,因仅需用表达与目的基因互补双链RNA的大肠杆菌喂食线虫即可实现。首先,本短片将介绍RNA干扰的概念和解释它如何导致目的基因表达下调。然后我们将演示在线虫中应用RNA干扰的步骤。包括大肠杆菌和RNAi线虫平板的制备,线虫培养以及如何评估线虫中RNA干扰的效果。RNA干扰经常用于反向遗传学筛选以揭示哪些基因对于执行特定的生物过程至关重要。另外,自动化反向遗传筛选能使表达下调更高效和并可用于大规模基因分析。最后,RNA干扰经常用于研究线虫的发育生物学。自它发明以来,科学家利用RNA干扰技术在解释许多生物学现象上取得重大进展。

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JoVE Science Education Database. 模式生物I:酵母,果蝇和秀丽线虫. 线虫RNA干扰的简介. JoVE, Cambridge, MA, (2019).

RNA干扰也称RNAi,是一种应用广泛的技术,它将双链RNA引入到生物体内从而导致目的基因沉默 。 获得诺贝尔奖的RNA干扰技术能让研究人员沉默线虫的任何基因表达从而研究其功能。为将RNAi引入线虫,我们可以先制备表达了目的基因双链RNA的大肠杆菌平板作为线虫的食物。然后将第四幼虫期的线虫转移到RNAi平板上培养并让其产卵。当子代到了需要研究的发育阶段,收集并分析子代表型。 RNA干扰技术经常用于线虫的反向遗传学筛选,自动高通量筛选以及作为研究发育进程的一个工具。本短片中,我们将讲述RNA干扰的概念,演示如何在线虫上使用RNA干扰技术。并将讨论科学家们是如何利用RNA干扰技术作为工具来更好地了解普遍的生物学过程。

让我们先从RNA干扰技术的工作原理开始。线虫实验中,线虫的食物大肠杆菌,已经被转化含有编码与目的基因互补的双链RNA的质粒。如前所提到的,线虫将被喂食这种被转化的细菌。通过一种目前仍未知的机制,双链RNA一旦被摄食就进入了线虫组织内。

进入细胞后,胞内的Dicer酶将双链RNA切为长度为21到23个核苷的小干扰RNA,也称之为siRNA。然后siRNA和RNA诱导的沉默复合物RISC结合,进而解链。这时,siRNA/RISC复合物通过互补碱基配对结合到目标mRNA。导致目标mRNA的降解从而下调基因表达。

在整个过程开始之前,先要制备表达所需双链RNA的细菌。目前,表达含上万个基因的双链RNA的载体细菌文库已经商品化。否则,目的基因序列就需通过标准克隆技术克隆到载体上。载体含有耐受氨苄抗生素的基因,能用于筛选含载体的阳性克隆。

接下来,利用标准转化技术将编码所需双链RNA的载体转化到能表达双链RNA的大肠杆菌DE3株系。同时也要转入一个空载体到 大肠杆菌作为对照。尤为重要的是用于实验的大肠杆菌株系要缺失RNA聚合酶 III,不然双链RNA就会被其消化掉。该大肠杆菌还含有一个IPTG诱导表达的T7DNA聚合酶,将转录载体上的双链RNA。 最后,DE3菌株还含有四环素和羧苄青霉素双抗性,以保证RNA聚合酶 III的表达和防止杂菌生长。

将转化后HT115(DE3)大肠杆菌平铺到含有12.5 微克/毫升四环素和25 微克/毫升羧苄青霉素的LB琼脂板上,37度培养过夜。 第二日早上平板上将出现大肠杆菌克隆。挑取单克隆到1毫升 含100微克/毫升氨苄青霉素 的LB液体培养基以筛选含质粒的大肠杆菌。37度震荡培养过夜。过夜培养后,加入5 毫升含100微克/毫升氨苄青霉素的LB培养液到培养物中,继续在37度培养4-6个小时。

准备好大肠杆菌后,就要制备用于喂食线虫的RNAi平板了。线虫RNAi平板含有琼脂,水,羧苄青霉素,线虫培养基混合物和用于诱导表达转录载体上的双链RNA的T7DNA聚合酶的IPTG。加入0.5ml的细菌到线虫RNAi平板37度培养过夜后,形成含菌层的平板。

在用RNAi平板培养线虫之前,让线虫的发育期同步十分重要,这样任何观察到的不同表型就不受发育期的不同所影响。要同步发育期,先火焰灭菌一支铂丝挑针。

用挑针将L4期线虫加到每个RNAi平板上,20度过夜培养。让其成为产卵期成虫。然后将其转移到新的RNAi平板上20度继续培养6-8小时。产完卵后,移走所有的成虫。这些卵将发育同步。最后,让线虫在RNAi平板上生长至目的发育期用于分析。

为了便于观察线虫,需要制备含有4%琼脂糖垫片的玻片。首先,在两个载玻片上粘上胶带作为隔板帮助制作厚度均一的琼脂糖垫片。在两个胶带玻片间放一干净的载玻片,用移液枪加150 µl 熔化的4%琼脂糖到载玻片上。迅速在垂直方向盖上另一载玻片,以覆盖熔化的琼脂糖。待凝固后,轻轻分离两个载玻片,琼脂垫片将会粘在其中一个载玻片上。

然后加入10 µl麻醉剂如叠氮钠到琼脂垫片上用于固定线虫。 用铂丝挑针将线虫移到含麻醉剂的琼脂糖垫片上并盖上盖玻片。 最后在显微镜下观察线虫。比较RNA干扰后基因下调的线虫与对照组线虫,记录大小,发育期,形态,荧光标记蛋白的定位方式以及其他表型的差异。

RNA干扰的一个最有价值的应用是它很容易用于反向遗传学筛选。 反向遗传学筛选是通过下调一组已知基因并评估表型结果来发现基因功能的手段。比如,研究人员能使用表达线虫基因组几乎所有基因的双链RNA的大肠杆菌文库。用多孔板培养这些大肠杆菌并用来喂食线虫。然后可以评估多个基因的RNA干扰的表型影响进而了解体内这些基因的正常功能。

自动化遗传筛选是一种极高通量的反向遗传学筛选。 在自动化遗传筛选时,利用机器人很容易操作上万个大肠杆菌克隆从而能将整个线虫基因组基因逐一沉默,再利用专门仪器来作定量分析。

例如,用线虫表达含转基因荧光报告基团的抗微生物多肽基因nlp29,通过细菌喂食将线虫中的上千个基因进行RNA干扰,同时将真菌孢子引入到线虫体内。然后评估抗微生物多肽对真菌感染的反应。

RNA干扰技术也常被用于研究线虫的发育。科学家们利用RNA干扰来下调任何感兴趣的基因或一组基因。然后评估这些基因在发育过程或发育时间点上如何影响发育进程。比如,RNA干扰可以帮助发现导致发育延迟的基因或参与器官发育的基因。

您刚观看的是JOVE关于线虫RNA干扰的介绍。我们知道了RNA干扰的工作原理以及如何通过大肠杆菌喂食来进行线虫RNA干扰。 RNA干扰是进行反向遗传学筛选,包括自动化高通量筛选的有力工具,同时也是研究发育生物学的有效方法。感谢您的观看。

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