果蝇幼虫的免疫组化

Biology I

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Summary

免疫组化(IHC)是一种用来观察组织中蛋白的存在和定位的技术。由于易于染色,果蝇幼虫特别适合用于免疫组化。此外,幼虫的身体透明也意味着不需要解剖就可以直接观察某些组织。

免疫组化里,目的蛋白最终是由特定结合该蛋白抗原位点的抗体检测得到。 为保护这些抗原位点,组织在染色前必须固定。另外,为了让抗体能穿过胞膜,细胞必须用去垢剂来通透。本视频详细介绍了染色解剖的幼虫组织,包括固定,封闭和染色步骤所需的试剂,工具和流程。同时也演示了荧光显微镜观察要用到的组织封片技术。最后举例说明了这些技术的广泛应用(以及基于这些技术的一些变化)。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 模式生物I:酵母,果蝇和秀丽线虫. 果蝇幼虫的免疫组化. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

黑腹果蝇之所以能成为一种广泛研究的模式生物是因为它方便且广泛的应用。 果蝇幼虫的免疫组化是一门宝贵的技术,它能提供目的蛋白是否存在,定位以及与其它蛋白共定位等相关信息。 本短片将讲述果蝇幼虫组织的解剖,固定,封闭和封片等技术手段,以及它们的应用。

免疫组化是将交联了标记的的抗体来定位结合到特定的抗原蛋白使其可显色用于观察的一门技术。

果蝇幼虫免疫组化的成败首先取决于正确的解剖。由于幼虫组织十分脆弱,对它的解剖要求非常精准且迅速。 解剖通常在磷酸盐缓冲液PBS中进行。取出的组织先暂时置于PBS缓冲液中,其pH值与幼虫体内pH值相同。 解剖完成后,果蝇幼虫免疫组化的下一步骤就是固定。

固定是指将组织放置于稀释好的含福尔马林的溶液中,用来保存组织。 固定液能防止组织中的蛋白被酶解破坏。 组织固定好后,以及接下来的免疫组化过程中,还要用含有Triton-X的PBS溶液PBST洗涤几次。 小剂量的去垢剂Triton-X100能破坏细胞表面张力,增加细胞通透性,以利于抗体和其他试剂进入。 固定和洗涤完成后,就可以开始封闭组织。

封闭液含有的蛋白可以结合组织并占据非特异性结合位点以避免抗体在该处结合。封闭有助于防止假阳性信号。 组织封闭好以后就可以准备染色。

染色是指高特异性的一抗结合到称之为抗原的目的蛋白。 交联了报告分子的二抗可以结合到一抗。 报告分子释放可见的定位信号,通常为自然荧光。 每一步的抗体孵育结束后,多余的抗体要洗涤除去以避免非特异性结合。 染色完成后,样品必须要封片。

为了观察染色结果,组织必须小心封存到载玻片上。 可以用一种粘稠的试剂或封片液来包裹组织材料。 封存好后,样品可在显微镜下进行观察。 现在我们已经了解了果蝇免疫组化的原理。接下来让我们看看是如何操作的。

本段视频中,我们将重点讲解果蝇幼虫脑组织固定后的免疫组化,包括所用的试剂和工具和相关步骤。 我们将用整个脑组织进行染色,也称整体染色。 除了解剖过程根据实验组织的类型不同而有区别。免疫组化中其他主要步骤是相同的。 所以我们将从固定步骤开始讲解。

幼虫脑组织解剖完成后,用移液管吸去PBS。 加入固定试剂,根据所用方法提示选择孵育时间,脑组织固定需23分钟。 固定完成后,用PBST洗涤样品4次。 样品在封闭液中室温孵育至少30分钟。

加入适度稀释的一抗,4度孵育过夜。 孵育完成后,室温下用移液器抽吸PBST洗涤脑组织四次。 加入二抗,4度孵育样品过夜,避光防止荧光曝光失 效。 再用PBST洗涤脑组织四次。

在封片剂中平衡脑组织一小时。 平衡完成后,将脑组织用去掉尖头的p200移液枪头移到载玻片上。 在周围铺上垫片以防止样品被压碎。 在样品上盖上盖玻片。 用指甲油封住盖玻片边缘。幼虫脑组织现在可以用来观察免疫组化结果了。

我们刚讲述了果蝇脑组织的免疫组化。接下来让我们了解免疫组化过程的一些可替换步骤。

可使用其他的解剖和固定技术来准备果蝇幼虫进行成像。 这个实验里,研究人员想要了解细胞如何形成特定形状。 他们设计实验去监测幼虫气管末端细胞的形态变化。 研究人员使用了一种可以表达GFP蛋白的突变果蝇品系。 GFP蛋白受水浴加热诱导表达。(13e)

在荧光解剖显微镜下筛选幼虫。 发出荧光的果蝇表明GFP蛋白成功激活。 这些果蝇通过加热这种方式来固定,而不需要进行解剖。 通过软件帮助检测,就可以识别气管分支和管腔的细胞形态变化。

果蝇卵巢是一个非常好的用于了解干细胞如何与其细胞环境相互作用的模型。

果蝇卵巢的免疫组化要先从区分带卵巢的雌蝇和带精巢的雄蝇开始。 将收集到的雌性幼虫转移到单个小凹孔中。然后小心地将其解剖打开取出带有卵巢的脂肪体。 脂肪体固定染色后,放置于载玻片上,再将卵巢从中剥离出来。封片后观察,荧光染色展示了幼虫卵巢中体细胞和原生殖细胞的所在位置。

果蝇幼虫的免疫组化可与蛹及成虫的免疫组化进行许多平行比较。 例如,研究人员可以用免疫组化来观察在幼虫,蛹及成虫等不同发育时期的果蝇视网膜。从而阐述幼虫,蛹和成虫之间免疫组化的特点。 这里的结果显示了果蝇不同发育时期的视网膜免疫组化特点。

果蝇幼虫的免疫组化是一种有多方面应用的技术手段。本短片里我们讲述了果蝇幼虫的免疫组化步骤包括解剖,固定,染色和封片。感谢您的观看!

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