Techniques de micro-injection du poisson zèbre

Biology II

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Summary

L'un des principaux avantages à travailler avec le poisson zèbre (Danio rerio), c'est que leur génétique peut être facilement manipulée par micro-injection des jeunes embryons. Grâce à cette technique, les solutions contenant du matériel génétique ou des séquences nucléotidiques pour l’inactivation génétique «knockdown» sont livrées dans les blastomères: les cellules embryonnaires adjacentes au sac vitellin d’un œuf nouvellement fécondé. L’administration dans le cytoplasme est possible soit par injection directe dans le blastomère, soit par l'intermédiaire des mouvements cytoplasmiques naturels qui se produisent après l’injection d’une solution dans le sac vitellin. Les manipulations génétiques qui réussissent sont généralement suivies par la quantification des phénotypes embryonnaires afin d'élucider les mécanismes génétiques du développement.

Cette vidéo fournit une introduction à la réalisation de micro-injections dans les embryons de poisson zèbre. La vidéo commence par une revue des outils essentiels pour la technique, y compris le dispositif d'injection et le micro-injecteur, qui contrôle le mouvement de la solution avec des changements de pression d'air. Ensuite, des étapes préparatoires importantes sont mises en évidence, comme la coulée d’agarose pour stabiliser les embryons durant l'injection et la calibration de l'appareil de micro-injection. La procédure d'injection est alors présentée ainsi que des conseils sur quand et où les injections doivent être effectuées. Finalement, les utilisations de la technique de micro-injection sont décrites, y compris la surexpression de gènes par l'intermédiaire d'ARNm injecté, l'inactivation de gènes par la livraison d'oligonucléotides antisens morpholino, et la génération d'un poisson zèbre transgénique en utilisant de l'ADN plasmidique spécialement conçu.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Les organismes modèles II : La souris, le poisson-zèbre et le poussin. Techniques de micro-injection du poisson zèbre. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

La micro-injection d'embryons de poisson zèbre permet aux chercheurs d’introduire des substances directement dans l'animal en développement, afin d'étudier la fonction des gènes et la dynamique de développement. Les embryons contenant de 1 à 4 cellules sont fréquemment utilisés pour l'injection. Parce qu’à ce stade précoce il n'y a pas de membranes séparant les cellules et le sac vitellin, les solutions injectées dans une cellule ou le sac vitellin seront réparties également dans tout l'organisme. En utilisant la micro-injection, les gènes codant des protéines peuvent être exprimés, ou désactivés, en fonction du type d’agent injecté. Cette vidéo montre la préparation de la pipette, la collecte des embryons, la procédure de micro-injection, et discute des usages courant de cette technique de laboratoire.

Tout d'abord, nous allons couvrir les principaux composants du système de micro-injection: Le stéréoscope, le micro-injecteur, le porte-pipette, et le micro-manipulateur.

Le micro-injecteur délivre un volume précis grâce à des impulsions de pression d'air, qui peut être réglé par l'utilisateur. Le porte-pipette soutient la pipette durant la procédure et le relie au capillaire de l'injecteur. Normalement, le porte-pipette est placé dans un micro-manipulateur. Cet instrument permet au chercheur de faire de petits ajustements précis de l’emplacement de la pipette au cours de la procédure d'injection. Une pédale de commande est reliée à l'injecteur et permet d’activer l’impulsion de pression d’air pour injecter la solution tout en gardant les mains libres. Enfin, le stéréoscope permet au chercheur de voir les embryons et de se concentrer sur l'emplacement de la pipette au cours de la procédure de micro-injection.

Avant de commencer la micro-injection, les aiguilles de verre doivent être préparées. Les aiguilles de micro-injection doivent être d'une taille uniforme pour permettre la livraison précise de solutions. Une étireuse de pipette garantit que des pipettes fines et pointues soient préparées à chaque fois. L'étireuse chauffe un tube capillaire en verre tout en exerçant une force qui tire sur ce tube, ce qui résulte en deux pipettes effilées.

Sous le microscope, en utilisant une pince, la pointe est coupée de façon à délivrer un volume constant de liquide tout en maintenant toujours la forme effilée de l'aiguille pour percer l'embryon du poisson zèbre.

Le rouge de phénol, un colorant utilisé pour aider à visualiser la procédure d'injection, peut être mélangé avec la solution d'injection dans le but de vérifier la réussite de l'injection dans l’embryon.

Les aiguilles peuvent être remplies avec la solution d'injection par leur pointe effilée par capillarité, ou elles peuvent être remplies avec une micro-seringue de remplissage appelée « microloader » en anglais. Une fois que l’aiguille est chargée pour l'injection, elle peut être insérée dans le porte-pipette sur le micro-manipulateur.

Une fois les aiguilles de micro-injection prêtes, les paramètres de pression et de temps de micro-injection sont ajustés afin de calibrer chaque aiguille, ce qui assure qu’un volume constant soit administré dans chaque embryon. Sous le stéréoscope, une petite quantité de solution est injectée dans une goutte d'huile minérale sur une lame. La taille de la goutte est mesurée et le volume dispersé peut être calculé pour chaque aiguille. Ensuite, la pression du micro-injecteur peut être réglée et le processus est répété jusqu'à ce qu'une goutte de la taille désirée soit obtenue de façon consistante.

Une fois les aiguilles remplies et calibrées, les embryons sont obtenus et préparés pour injection. Les embryons doivent être positionnés avec soin dans la chambre de micro-injection et doivent être maintenus immobiles durant l'injection. Pour créer une chambre de micro-injection, un moule est placé dans une boîte de Pétri et de l'agarose fondu est versé dans le moule, qu’on laisse ensuite durcir.

Une fois l’agarose solidifié, le moule est retiré et le milieu de culture pour l'embryon est versé. Les embryons peuvent être alignés dans des auges qui ont été créées par le moule à l'aide d'une pipette de transfert. Une alternative à l'agencement des embryons dans l'agarose est de les aligner sur le bord d'une lame de microscope, de sorte qu'ils soeint positionnés en colonne pour la micro-injection.

Une fois qu'ils sont en position, les embryons sont prêts à être injectés.

Les embryons peuvent être injectés, soit dans leur sac vitellin soit dans le cytoplasme cellulaire. L'injection dans le sac vitellin est plus simple et nécessite une technique d'injection moins sophistiquée, alors que l'injection dans le cytoplasme est plus difficile, mais donne des résultats plus robustes.

Pour injecter dans le sac vitellin, utilisez le micro-manipulateur pour déplacer l’aiguille de sorte qu'elle perce le chorion et le sac vitellin. La pédale de commande est alors mise à profit pour expulser le contenu de l’aiguille dans le sac vitellin. Le flot cytoplasmique et la diffusion permettent à la solution injectée d’entrer dans la cellule.

L'injection dans le cytoplasme nécessite un positionnement soigneux de l'embryon, de sorte que le cytoplasme puisse être efficacement ciblé.

Après l'injection, les embryons sont transférés sur une nouvelle plaque et incubés à 28,5 °C. Ils sont fréquemment examinés pour éliminer les embryons morts.

Pour déterminer le succès de l'injection, les embryons peuvent être analysés en fonction de leur apparence générale, la présence d'un marqueur fluorescent, et par la recherche de modifications de leur génome en utilisant le génotypage.

Maintenant que vous comprenez comment injecter des embryons de poisson zèbre, regardons comment les scientifiques peuvent utiliser cette technique pour comprendre la fonction de certains gènes.

Tout d'abord, les scientifiques peuvent injecter de l'ARNm synthétisé pour traduire certains gènes et déterminer leur fonction en observant le phénotype. Cette même technique peut également être utilisée pour exprimer des protéines qui mettent en évidence les événements moléculaires, tels que les réarrangements du cytosquelette qui se produisent au cours du développement.

Deuxièmement, les gènes peuvent être désactivés par l'injection de morpholinos. Les morpholinos sont des analogues stables d'acides nucléiques synthétiques qui peuvent être conçus pour se lier à des séquences d'ARNm spécifiques par appariement standard de base d’acide nucléique, ce qui bloque la traduction. En retour, cela conduit à la perte de la protéine produite par cet ARNm. Cet effet permet aux chercheurs de comprendre le rôle d'un gène particulier dans le développement en voyant comment le développement est modifié en son absence.

L'injection peut être utilisée pour incorporer de l'ADN étranger dans le poisson zèbre. En injectant des séquences contenant des sites de reconnaissance pour des enzymes de modification de l'ADN, les scientifiques peuvent générer efficacement des poissons "transgéniques" c’est à dire avec un génome modifié, ce qui signifie que les gènes étrangers seront transmis aux générations futures. En fonction de la séquence sélectionnée, l'expression du gène peut être limitée à des tissus spécifiques ou à des périodes spécifiques du développement.

Vous venez de regarder l'introduction de JoVE à la micro-injection de jeunes embryons de poisson zèbre. Cette vidéo a introduit l’équipement pour la micro-injection, démontre comment préparer les aiguilles de micro-injection, montre comment préparer les embryons pour la micro-injection, réalise la technique de micro-injection, et explique certaines applications de la micro-injection. Comme toujours, merci de nous avoir regardé!

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