斑马鱼育种和胚胎的操作

Biology II

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Summary

斑马鱼是一种重要的模式生物。它对发育生物学的研究特别有用。首先,斑马鱼多产,每星期能产生几百个后代,因此,很容易收集到大量的胚胎用于高样本数研究。其次,斑马鱼发育速度快,而且胚胎透明,这使得我们能方便观测发育进程。

本短片展示了收集新受精斑马鱼胚胎的步骤。我们首先简单回顾了斑马鱼的交配行为,然后我们介绍了在特殊的实验室繁育鱼缸内建立杂交系。这种鱼缸可以让我们控制斑马鱼的交配。同时我们还说明了设置好鱼缸后在早上激发排卵(也叫大量排卵)的条件。接下来我们介绍了胚胎操作的关键技术,包括用化学物质PTU和脱氯作用抑制色素的产生以及去除包围胚胎的壳样的膜(卵壳)。最后,我们还介绍了这些技术在发育生物学研究中的实际应用。

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JoVE Science Education Database. 模式生物II:小鼠,斑马鱼和鸡. 斑马鱼育种和胚胎的操作. JoVE, Cambridge, MA, (2019).

斑马鱼虽小却是非常强大的模式动物。这种鱼能每星期产数百个后代,其整个生命周期中能产成千上万的后代。发育迅速和身体透明使得斑马鱼胚胎是很多应用的理想选择。本短片将显示基本的斑马鱼胚胎的收集和操作,然后会介绍当前运用斑马鱼胚胎的研究方法。

要想获得胚胎,需要先了解一下斑马鱼的交配行为。

斑马鱼是进行有性生殖的,所以繁育需要雄鱼和雌鱼。雄鱼的身体较细长,略带红色;雌鱼有着大大的银色的装满鱼卵的肚子。

周期性的交配可以让卵健康,但产生这些卵却要花很多功夫,所以每条雌鱼每周只应交配一次。

最后,像许多其他的动物一样,鱼类的交配行为也是由感觉过程介导的。来自雄鱼的嗅觉信号能让雌鱼开始准备大量产卵,而一点点的光线会让他们开始交配。

知道如何辨别雄鱼和雌鱼后,现在让我们来建立斑马鱼的杂交。为了斑马鱼的繁育,研究者使用的是为杂交特殊设计的鱼缸。繁育鱼缸通常都有一个可以移动的带着小孔的插板。小孔允许掉落的鱼卵通过,避免其被饥饿成鱼吃掉。

首先我们将成鱼于下午或晚上放入育种鱼缸中。要想于第二天早上收集早期胚胎,我们先用一个挡板分隔雄鱼和雌鱼,这会在你准备开始实验以前阻止其交配,为防止鱼从鱼缸中跳出,一定要用盖子盖住育种鱼缸。然后,让鱼彼此适应过夜。

当鱼在育种鱼缸中一起过夜后,他们会在第二天早上交配。

因此早上的第一步就是去除挡在雄鱼和雌鱼中间的挡板来引发排卵行为。如果没有使用挡板,一见到光照不久鱼就排卵了。

当雄鱼在鱼缸中追逐雌鱼时,雌鱼开始排卵,雄鱼也将精子排入水中适卵受精。等待大约15-30分钟。然后用鱼网将成鱼移出繁育鱼缸,或者抬起鱼缸的插板,将鱼放入另一个鱼缸。

接下来,我们将水和胚胎一起倒过一个滤网来收集鱼卵。然后我们用过滤的“鱼卵水”将胚胎从滤网上洗脱到一个培养皿中。你也可以转移胚胎将胚胎的密度调整到每培养皿50-100粒。为了保证胚胎发育能正常进行,我们将培养皿放于28.5摄氏度的培养箱中。

获得胚胎后请小心操作。他们对您的实验很重要!现在,让我们来回顾一些要点。

要保证胚胎健康,培养皿的水要保证清洁没有残骸。死了的胚胎会变得不透明没有光泽,每天都需要去除掉。另外,可以在水中添加亚甲基蓝来防止真菌生长。

当您需要将胚胎从一个培养皿移到另一个培养皿时,请用移液管。通过旋转培养皿,您可以将胚胎聚集在培养皿的中间以方便吸取。

有的实验流程会包括一些胚胎维护的额外步骤。比如说在发育早期的前三天,斑马鱼的胚胎是在卵壳内发育,这层卵壳阻碍了胚胎的遗传学操作。这层卵壳可以通过用蛋白水解酶pronase处理去除,或者也可以通过镊子手动去除。另外,斑马鱼在24小时后开始产生色素,就象这条斑马鱼幼体显示的这样,这会干扰显微镜观察。要想解决这个问题,科学家向培养水中添加PTU,它会抑制黑色素的产生。

现在您已经知道如何获得并培养斑马鱼胚胎。那么让我们来看看研究者是如何利用他们来进行科学发现的。

斑马鱼胚胎的外部发育可以通过显微注射DNA, RNA 或基因敲除试剂来进行遗传学操作。显微注射使注入的物质均匀分布于整个胚胎并产生可见的表型,这些表型是某种蛋白过量表达或缺失的结果。同样的技术也可以用于产生转基因鱼。在这些转基因鱼身上,特定的结构被用荧光蛋白标记。

另外,斑马鱼的胚胎和幼体个体小,这使得他们成为表型化学筛选的理想工具。这里我们显示胚胎被放置于96孔板中,然后我们通过向水中添加化学物质来进行小分子化学库的处理。随后,这些平板里的鱼被用来进行形态学缺陷的筛选,就像这里展示的发育畸形的鱼。

最后,斑马鱼胚胎透明,这使得他们非常适合显微镜观察。在特定细胞类型中表达了荧光蛋白的活的胚胎可以被固定住,用共聚焦显微镜观察。这使得研究者能检测发育组织中细胞随时间的移动。

您刚观看的是JoVE关于斑马鱼繁育和胚胎操作的短片。本短片中,我们讨论了斑马鱼杂交的基本知识,如何准备繁育鱼缸以及胚胎的操作。我们还讨论了运用这种小而强大的胚胎进行研究的方法。谢谢观看。

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