Summary
Overview
Eine Stärke des Kükens (Gallus gallus domesticus) als Modellorganismus für die Entwicklungsbiologie ist, dass sich der Embryo außerhalb des Weibchens entwickelt und daher leicht für die genetische Veränderung zugänglich ist. Viele Verfahren ermöglichen es den Forschen die Hühnerembryos in der Eierschale (in ovo) zu untersuchen, aber der Zugriff auf den Embryo ist beschränkt für Embryonen in späteren Entwicklungsstadien. Glücklicherweise können Küken ex ovo, also außerhalb der Eierschale, kultiviert werden. Der Hauptvorteil der ex ovo Kultur ist der größere Zugriff zu Geweben, die anderweitig durch die Schale oder die Ausrichtung des Kükens in der Schale, speziell für Embryos in späteren Entwicklungsstadien, blockiert wären.
Es gibt zwei grundlegende Strategien für die ex ovo Kultur: die Gesamtdotterkultur und die Explantatkultur. Für die Gesamtdotterkultur bricht man die Eierschale auf und transferiert den Inhalt in ein Behausungsmodul. In Explantatkulturen wird der Embryo von dem Dotter entfernt und auf einem Behausungsmodul befestigt, um die Spannung der Membran zu bewahren, welche wichtig für die spätere Entwicklung ist.
Grundlegende Protokolle für die Gesamtdotter- and die Explantatverfahren werden in diesem Video bereitgestellt, zusätzlich zu Diskussionen über das Für und Wider des Kultivierens von Küken außerhalb der Schale.
Zu letzt behandeln wir die experimentellen Anwendungen einer ex ovo Kultur, und zeigen wie diese Vorgehensweise benutzt wird, um den Zugriff auf die Embryonen für die Mikroskopie und genetische Veränderung von Embryonen in späteren Entwicklungsphasen, zu verbessern.
Procedure
Das Küken ist ein vielfältiger Modellorganismus, um Entwicklungspfade zu untersuchen, weil die Mehrheit der Entwicklung außerhalb der Mutter stattfindet. Trotzdem verhindert die Eierschale den Zugriff auf den Embryo für einige Arten von Experimenten. Glücklicherweise können die Küken außerhalb der Schale, oder ex ovo, mit allgemein erhältlicher Laborausrüstung, inkubiert werden. In diesem Video werdet ihr die Grundlagen einer ex ovo Kultur, eine Schritt für Schritt Anleitung für zwei verschiedene experimentelle Methoden, und einige Anwendungen dieses Verfahrens in Entwicklungsstudien, lernen.
Bevor wir darüber sprechen, wie man Küken ex ovo aufzieht, erläutern wir einige Grundlagen dieses Verfahrens. In dem Ei entwickelt sich das Küken in enger Verbindung mit der Vitellinmembran, die das Dotter umrundet. Das übrige Volumen wird durch das Albumin, oder Eiweiß, gefüllt, welches den Embryo beschützt und als Proteinquelle dient. Die Kultur außerhalb des Eies kann als Gesamtdotterkultur, die alle Komponenten des Eies in einem einfachen Behältnis enthält, ausgeführt werden. Als Alternative können die embryonalen Gewebe auch ausgeschnitten und als ex ovo Explantatkulturen gewachsen werden. Beide Verfahren haben bestimmte Vorteile im Vergleich zu der Benutzung von Eiern mit Fenstern.
Erstens ist das Schneiden eines Fensters in Hühnerembryonen im Spätstadium kompliziert, da es viele wichtige Blutgefäße gibt, die sich in den Membranen, die das Küken einhüllen, entwickeln. Das macht die ex ovo Methode besser geeignet, um mit Küken in späteren Entwicklungsstadien zu arbeiten.
Zweitens passen ex ovo Kulturen in ein Abbildungssystem und sind daher besser geeignet für die hochauflösende Bildgebung. Außerdem legt das Entfernen der Embryos aus der Schale eine größere Anzahl an Geweben für die experimentelle Veränderung, wie zum Beispiel für die Mikrooperation oder die Mikroinjektion, frei.
Da sich das Küken auf die Eisschale für Schutz und wichtige Mineralstoffe verlässt, ist für das Überleben des Embryos ohne diese Struktur besondere Sorgfalt geboten. Zum Beispiel muss die Behausung so gemacht sein, dass eine sterile, feuchte Umgebung erhalten wird, und dass Nährstoffe als Albumin oder Kulturmedium zur Verfügung gestellt werden. Für die längerfristige Kultur wird zerbrochene Schale als Kalziumquelle benötigt. Da außerdem die Spannung der Membranen, die den Embryo stützen, wichtig für die normale Entwicklung ist, ist die erfolgreiche ex ovo Kultur zusätzlich abhängig von einer Behausung, welche die normale Membranentopologie bewahrt.
Nun dass wir die Grundlagen kennen, ist es Zeit die Küken rauszubekommen! Um die Eier für die ex ovo Gesamtdotterkultur vorzubereiten, fängt man mit ihrer Inkubation bei 37.5°C an, bis sie die gewünschte Entwicklungsstufe erreicht haben.
Während wir warten, bereiten wir die Behausung vor. Petrischalen, Wägeschiffchen, und Hängematten werden häufig benutzt, um den Inhalt der Eier aufzunehmen. Zu erst sterilisiert man alle Komponenten mit UV Licht Behandlung oder Ethanol. Zusätzlich bereitet man die äußere Kammer, die mit destilliertem Wasser gefüllt ist, vor, um die Luftfeuchtigkeit während der Inkubation zu erhalten.
Wenn die Eier fertig sind, setzt man sie für ein paar Minuten in eine horizontale Position, so dass die Embryonen zu dem oberen Teil aufsteigen können. Dann zerbricht man die untere Schale und transferiert den Inhalt des Eies vorsichtig in die Behausung. Zum Schluss bedeckt man die Behausung, um die Luftfeuchtigkeit zu erhalten, und platziert den Aufbau bis zu dem gewünschten Alter für die nachfolgende Verwendung in einen Inkubator.
Eine Alternative der ex ovo Strategie ist die Explantatkultur, welche ein paar weitere Schritte erfordert nachdem der Embryo aus der Schale entnommen wurde. In diesem Verfahren wird die Vitellinmembran sanft von dem Dotter getrennt, so dass der sich entwickelnde Embryo mitgenommen wird. Danach wird die Membran befestig, um die Spannung zu erhalten. Das kann erreicht werden, indem man das Gewebe eng um einen Glasring zieht, oder durch einfaches Anhaften an Filterpapier. Nach der Befestigung gibt man Kulturmedium hinzu um das Gewebe zu bedecken, und der Embryo wird in eine befeuchtete Kammer gestellt. Die explantierten Embryos können nun für 24 Stunden zurück in den Inkubator gestellt werden für die weitere Entwicklung
Nachdem wir über die Grundlagen dieser ex ovo Kulturmethoden gesprochen haben, sind wir bereit für mehr! Ex ovo Kulturen sind besonders nützlich wenn man die Genexpression von älteren Embryonen beeinflussen möchte. Eine Vorgehensweise dafür ist die Elektroporation, in welcher ein elektrischer Strom benutzt wird, um die Zellmembran durchlässig zu machen, und dadurch genetisches Material abzuliefern. Da die ex ovo kultivierten Embryos sehr gut für die Bildgebung zugänglich sind, kann die Aufnahme von fremdem, genetischem Material einfach durch die fluoreszente Bildgebung an ganzen Embryonen bestätigt werden.
Die Echtzeitbildgebung der Zelldynamik ist auch möglich mit einer ex ovo Kultur. Humane Krebszellen können Tumore bilden, indem sie die Blutgefäße der chorioallantoischen Membran (kurz: CAM) des Kükens übernehmen. Nach der Tumorbildung können fluoreszente Partikel direkt in den Blutkreislauf injiziert und in Echtzeit verfolgt werden. Die Ansammlung von Partikeln im Tumorgewebe kann als Indikator der Angiogenese, also der Bildung neuer Blutgefäße, genutzt werden.
Auch wenn die ganzen Embryonen mittels Explantatverfahren kultiviert werden können, erfordern einige Experimente die Präparation der Gewebe vor der Kultur. Zum Beispiel kann sich entwickelndes neuronales Gewebe entfernt und auf einem Deckglas aus Glas gewachsen werden. Nach der Inkubation kann beobachtet werden, wie sich eine bestimmte Population von Zellen, die auch als Neuralleiste bekannt ist, weg von dem Gewebe bewegt. Die Behandlung mit experimentellen Reagenzien und die Zeitrafferbildgebung können verwendet werden, um zu testen welche Faktoren die Zellmigration beeinflussen.
Das war JoVE’s Einführung in die ex ovo Kultur von Küken. Dieses Video hat die Prinzipien der ex ovo Kultur, die Grundlagen der Gesamtdotter und Explantatmethode, und einige Wege, wie diese Verfahren heutzutage in Labors verwendet werden, gegeben. Danke für eure Aufmerksamkeit!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
