膜片钳电生理技术

Neuroscience

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Summary

神经元细胞膜上有离子通道,它们控制电荷流入和流出细胞,从而调节神经元激发。一种用于研究这些通道的生物物理学特性的极为有用的技术被称为膜片钳记录。在这种方法中,神经科学家把抛光的玻璃微吸管置于细胞上通过吸力形成高电阻封接。这个过程分隔了一小“片“包含一种或多种离子通道的膜。通过微吸管中的电极,研究人员可以“钳制”或控制膜的电属性,这对分析通道活动很重要。该电极还能记录跨膜电压的变化,或离子通过膜的流动。

本短片首先回顾了膜片钳电生理学的原理,介绍了必要的设备,描述了各种类型的膜片钳测量模式,其中包括全细胞式,细胞粘附式,穿孔式,内翻外式和外翻外式膜片钳。接下来,概述了一个典型的全细胞膜片钳实验的关键步骤,并做了电流 - 电压(IV)曲线。最后,我们提供了膜片钳记录的应用以演示如何在当今的神经生理学实验室里评估离子通道的生物物理学特性,细胞的兴奋性,和神经活性化合物。

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JoVE Science Education Database. 神经科学的基本知识. 膜片钳电生理技术. JoVE, Cambridge, MA, (2019).

膜片钳记录是一项非常有用的技术,它用于研究控制神经元激活的离子通道的生物物理学特性。

该方法需要将玻璃微电极压在细胞上以隔离出一小“片”的细胞膜,其中包含一个或多个离子通道。

实验装置还让科学家能通过精确控制通过细胞膜的电压“钳制”该膜片的电环境,根据离子通道类型的不同,它将影响通过该膜的离子流动并允许对这些通道进行复杂的研究。

本短片概述了膜片钳技术背后的原理,描述进行实验所需的步骤,最后将介绍该方法的一些应用。

首先,让我们回顾膜片钳记录技术背后的原理。

神经元内外带正电荷和负电荷的离子数目不同。

这种不平衡产生约-70 mV的电压差,或膜电位,这意味着膜内的电位较膜外为负。

离子通道通过控制穿过细胞膜的离子流动维持膜两边的梯度,离子流动本质上就是电流。

利用膜片钳技术,科学家想了解电势和电流的性质。

膜片钳装置包括一个玻璃微吸管,其中含有离子溶液和用于测量电压和电流的氯化银电极。

微量吸管的尖端有一个抛光的,一微米直径的开口,它能围起细胞膜的一个小区域。

要消除来自槽液中离子的背景噪声,必须在玻璃吸管和膜片之间形成高电阻封接。因为封接的电阻是在千兆欧姆的范围内,它被称为吉欧封接。

吸管内的电极与一个放大器相连,它可以放大电流和电压的波动,这种波动是离子流动穿过质膜上的通道造成的结果。

有了放大器,科学家可钳制或将膜电位人为设定在特定的电压。

放大器调节应该让多大的电流通过银电极,以保持电压的恒定。

由于不同的电压 - 门控离子通道在不同的电压开放,打开事件由在所测电流的变化来指示。

另外,科学家们可以强制一个特定的电流通过电极并记录电位产生的变化。

在这个“电流钳”装置中,动作电位可以被记录。

现在让我们来看看五种主要类型的膜片钳测量模式。

第一种是细胞粘附式测量,它只是简单地将微吸管封接到一个完整细胞的细胞膜上。

第二种是全细胞式测量,微吸管中的膜被破坏,使得与细胞内部相通。

第三种是穿孔式测量。在这里,化学药品,比如抗生素被加入到微吸管中,从而在细胞膜上形成与细胞质相通的小孔。

第四种是内翻外式测量。为了实现这一点,微吸管首先形成与细胞的封接,然后快速拉回微吸管,撕下一块膜片并将膜片的内表面暴露在槽液中。

这使得通道的胞质侧面暴露于添加在槽液中的不同化学物质。

最后一种,类似于内翻外式,是外翻外式测量。先形成全细胞式封闭,然后慢慢抽出微吸管直到一块膜在整个微吸管的尖端形成凸密封。

在此模式中,通道的胞外表面可以受到实验处理。

现在我们已经回顾了膜片钳的原理,让我们来看看进行膜片钳记录所需的步骤。

首先要用玻璃电极拉制器将硼硅玻璃管拉成微吸管。

然后,用火来抛光微吸管的尖端来得到合适的直径和阻力。

抛光后,将离子溶液注入到微吸管中并轻弹赶走气泡。

然后将微吸管插入到电极支架上。

一旦连接好,我们用注射器向电极施加正压,以防止其他的溶液进入微吸管尖端。

现在,将您感兴趣的细胞或组织放在显微镜台上并让微电极移向细胞。

用放大器产生测试电压脉冲,记录下电阻,一旦电极接触到细胞,电阻将增大。

为了形成吉欧封接,用注射器轻轻地将正压转换为负压。

封接的形成会导致电阻快速增大到超过1千兆欧姆。

现在,细胞粘附式膜片钳已经建立,让我们转换为全细胞式并做一个实验!

记得在全细胞式测量中膜是破裂的。

破裂是通过施加负压到微电极上完成的。

一旦细胞膜破裂,测试脉冲的形状将有大电流瞬变,就好像细胞膜现在充当一个电容,它由测试脉冲充电。

任何给定的神经元上的单个离子通道类型的性质可通过药物阻断其它通道的活性来进行研究。

按照电压阶跃实验方案来检测因阶跃电压到一系列不同的保持电位所诱发的离子通道电流。

电流 - 电压或IV曲线显示了电压与流经离子通道的电流相关,并让我们了解了在哪些电压下通道是开放的还是闭合的。

现在让我们来看看神经科学家使用这种技术的几个应用。

有时,在神经元中发现的离子通道可以在非细胞环境中进行研究。

这里科学家们将离子通道蛋白加入到人工脂质膜上用来分开研究这些通道。

然后这些通道可以被暴露在试验分子,如辣椒衍生的辣椒素中,以研究它们对通道活性的影响。

由于离子通道能被暴露于细胞外环境,并能显著影响细胞功能,它们是非常好的药物靶点。将试验化合物加入到微电极或槽液中后,可用膜片钳记录直接测试这些药物,如尼古丁对神经活动的作用。施加负压形成高电阻封接的原理,甚至被应用于构建高通量的设备,它可以同时记录许多细胞用于药物筛选。

全细胞膜片钳技术是测量单个细胞对刺激反应的有用工具。

此外,成对记录可以用于研究神经元发放对可激发靶细胞,如肌肉的影响。在这个例子中,全细胞膜片钳用于刺激运动神经元的发放,并同时记录下被它控制的肌肉纤维。这样就观察到了神经元兴奋性和肌肉活动之间的明确关系。

您刚观看的是JoVE对膜片钳记录技术的介绍,其中回顾了技术背后的原理和进行实验的步骤。

由于膜片钳记录对电压和电流变化有着精密的瞬间敏感性,它将继续帮助了解通道和神经元的生物物理学性质。

感谢观看!

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