L’électrophysiologie patch-clamp

Neuroscience

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Summary

Les membranes cellulaires des neurones sont peuplées de canaux ioniques qui contrôlent le déplacement des charges vers et hors de la cellule, régulant ainsi l’activité électrique des neurones. Une technique extrêmement utile pour l’étude des propriétés biophysiques de ces canaux est appelée l’enregistrement par patch-clamp. Dans cette méthode, les neuroscientifiques placent une micropipette de verre polie contre une cellule et appliquent une succion pour former un joint de haute résistance. Ce procédé isole une petite partie (« patch ») de la membrane qui contient un ou plusieurs canaux ioniques. En utilisant une électrode à l’intérieur de la micropipette, les chercheurs peuvent fixer (« clamp ») ou contrôler les propriétés électriques de la membrane, ce qui est important pour l’analyse de l’activité du canal. L’électrode permet aussi aux changements de tension à travers la membrane, ou aux flux d’ions à travers la membrane, d’être enregistrés.

Cette vidéo commence avec une vue d’ensemble sur les principes derrière l’électrophysiologie patch-clamp, une introduction à l’équipement nécessaire et les descriptions des divers configurations de « patch », incluant la cellule entière, la cellule attachée, la perforée, l’inside-out et l’outside-out. Ensuite, les étapes clés d’une expérience typique de patch-clamp cellule entière sont définies, dans laquelle une courbe de courant-tension est générée. Finalement, des utilisations d’enregistrement de patch-clamp sont fournies pour démontrer comment les propriétés biophysiques des canaux ioniques, l’excitabilité cellulaire et les composés neuro-actifs sont évalués dans les labos de neurophysiologie aujourd’hui

Cite this Video

JoVE Science Education Database. L’essentiel de la Neuroscience. L’électrophysiologie patch-clamp. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

L’enregistrement patch-clamp est une technique extrêmement utile pour l’étude des propriétés biophysiques des canaux ioniques qui contrôlent l’activation neuronale.

La procédure implique de presser une micropipette en verre sur une cellule, en vue d’isoler une petite partie « patch » de la membrane qui contient un ou plusieurs canaux ioniques.

L’installation expérimentale permet encore aux scientifiques de fixer « clamp » l’environnement électrique de la zone, en contrôlant précisément la tension à travers la membrane cellulaire, tension qui, en fonction des canaux ioniques présents, impacte le flux d’ions traversant la membrane et permet une étude complexe de ces canaux.

Cette vidéo présente un aperçu des principes derrière la technique de patch-clamp, une description des étapes nécessaires pour exécuter une expérience et finalement quelques utilisations de cette méthode.

Tout d’abord, regardons les principes sur lesquels sont basés l’enregistrement patch-clamp.

Le nombre d’ions chargés positivement et négativement à l’intérieur d’un neurone diffère du nombre présent à l’extérieur.

Ce non-équilibre génère une différence de tension, ou un potentiel de membrane, d’environ -70 mV, ce qui signifie que l’intérieur est plus négatif que l’extérieur.

Les canaux ioniques aident à maintenir le gradient en contrôlant le mouvement des ions à travers la cellule membranaire, ces mouvements sont des courants électriques.

En utilisant la technique du patch-clamp, les scientifiques posent des questions à propos de la nature du potentiel et du courant.

L’équipement du patch-clamp inclut une micropipette en verre, qui contient une solution ionique et une électrode d’argent chlorée pour mesurer tensions et courants.

Le bout de la micropipette a une ouverture polie d’un micron qui encercle une petite zone de membrane.

Pour éliminer le bruit de fond dû aux ions à l’intérieur du bain de solution, un joint de haute résistance est formé entre la pipette et le morceau de membrane. Parce que la résistance de la jonction est dans la gamme du giga-ohm, il est appelé joint giga-ohm.

L’électrode à l’intérieur de la pipette est connectée à un amplificateur qui peut amplifier le courant et les fluctuations de tension qui sont le résultat du mouvement des ions à travers les canaux dans la membrane plasmique.

Avec l’amplificateur, les scientifiques peuvent fixer ou paramétrer artificiellement le potentiel de membrane à des tensions spécifiques.

L’amplificateur régule quelle quantité de courant doit être ajoutée à travers l’électrode en argent en vue de garder la tension constante.

Vu que les canaux ioniques voltage-dépendants (ou tensiodépendants) s’ouvrent à des tensions spécifiques, les évènements d’ouverture sont représentés par des variations dans les profils des courants mesurés.

Alternativement, les scientifiques peuvent envoyer un courant spécifique à travers l’électrode et enregistrer les changements résultants du potentiel.

Dans cette configuration en « current-clamp » (ou mesure de potentiel en courant imposé) des potentiels d’action peuvent être enregistrés.

Regardons maintenant les cinq types principaux de configurations de patch-clamp.

Tout d’abord la configuration « cellule attachée » où la micropipette est simplement scellée à la membrane d’une cellule intacte.

Deuxièmement, la configuration « cellule entière » où la membrane à l’intérieur de la micropipette est rompue pour fournir un accès à l’intérieur de la cellule.

Troisièmement, la configuration « perforée ». Ici, des produits chimiques comme des antibiotiques sont ajoutés à la micropipette afin de trouer la membrane par endroits fournissant un accès au cytosol.

La quatrième configuration est l’ « inside-out ». Pour réaliser ceci, la micropipette forme d’abord un joint avec la cellule, puis elle est retirée rapidement, arrachant un morceau de membrane et exposant la surface intérieure au bain de solution.

Ceci permet au côté cytoplasmique des canaux d’être exposé à des produits chimiques différents appliqués au bain.

Finalement, similaire à l’inside-out, l’outside-out commence comme une configuration cellule entière. La micropipette est lentement retirée jusqu’à ce qu’un morceau de membrane forme un joint convexe à travers l’embout.

Dans ce paramétrage, le côté extracellulaire des canaux peut être exposé à des traitements expérimentaux.

Maintenant que nous avons passé en revue les principes, regardons les étapes nécessaires à la réalisation d’un enregistrement patch-clamp.

Commencez en étirant un tube en verre de borosilicate en une micropipette, en utilisant un étireur de pipette.

Ensuite, polissez l’embout au feu pour obtenir le diamètre et la résistance appropriés.

Après le polissage, remplissez la micropipette avec une solution ionique et tapotez doucement pour déloger toute bulle d’air.

Ensuite glissez la micropipette autour de l’électrode attachée à un porteur.

Une fois attachée, utilisez une seringue pour appliquer une pression positive à la pipette, ce qui empêche d’autres solutions d’entrer par l’embout.

Maintenant, placez vos cellules ou tissus d’intérêt sur le plateau du microscope et déplacez la micropipette vers une cellule.

Avec l’amplificateur générant des impulsions de tension, enregistrez la résistance, qui va accroitre une fois que l’embout touche la cellule.

Pour former le joint giga-ohm, modifiez doucement la pression de positive vers négative en utilisant la seringue.

La formation du joint résultera en une augmentation rapide de la résistance à une valeur supérieure à 1 giga-ohm.

Maintenant qu’une configuration cellule-attachée a été établie, convertissons-la en une configuration cellule entière et réalisons une expérience !

Rappelons qu’une configuration cellule entière est lorsque la membrane est rompue.

La rupture est réalisée par l’application d’une pression négative à la micropipette.

Une fois que la membrane rompt, la forme de l’impulsion aura de larges courants transitoires, vu que la membrane agit maintenant comme une capacité, qui est chargée par l’impulsion de test.

Les propriétés d’un type de canal ionique seul dans n’importe quel neurone peuvent être investiguées par le blocage de l’activité des autres canaux pharmacologiquement.

Un protocole par étape de tension est utilisé pour examiner les courants des canaux ioniques provoqués par l’intensification de la tension à des séries de potentiels de maintien différents.

La courbe courant-tension montre la dépendance de la tension en fonction du courant passant à travers un canal ionique et fournit une vue sur les tensions auxquelles le canal est ouvert ou fermé.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à l’enregistrement de patch-clamp dans lequel nous avons passe en revue les principes desquels découle la technique et les étapes d’exécution d’une expérience.

Avec sa magnifique sensibilité temporelle aux changements de tension et de courant, l’enregistrement patch-clamp continuera à jouer un rôle important dans la compréhension de la biophysique des canaux et des neurones.

Merci de nous avoir regardés!

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