神经元钙成像

Neuroscience

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Summary

钙离子在神经元功能中起着重要的作用:它们作为细胞内的信号可触发响应,如改变基因表达和突触囊泡中神经递质的释放。由于细胞内有离子泵在各种信号刺激下选择性地运输这些离子,胞内钙浓度是高度动态的。钙成像利用钙离子流的优势,在活神经细胞上直接可视化钙信号。

本短片首先概要介绍了钙成像技术中的主要试剂,即被称为钙指示剂的染料。讨论部分介绍了常用的染料Fura-2,以及荧光比率型和非荧光比率型钙指示剂的基本工作原理。接着介绍了一个典型的钙成像实验,从细胞和染料的准备,到荧光图像的采集和分析。最后介绍了钙成像的几个实验应用,例如对神经元网络活动和感觉信息处理的研究。

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JoVE Science Education Database. 神经科学的基本知识. 神经元钙成像. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

钙成像一项非常有用的技术,它研究钙离子在正常工作的神经元中的各种功能。钙离子能产生许多控制细胞关键功能的胞内信号,如神经递质从突触囊泡的释放。钙成像技术能直接测量神经元和神经元组织中动态的钙流动。本短片概要介绍了钙指示剂染料的工作原理和基本操作步骤,最后讨论了该技术的一些实际应用。

首先,让我们看看钙指示剂染料的生化原理。

钙指示剂染料是修饰过的螯合剂分子,如Fura-2,它由两个主要成分组成。首先是螯合位点,能选择性结合钙离子。其次是荧光位点,当用激发波长的紫外光照射时能发射特定波长的光。

钙与染料的结合能够改变染料的荧光特性,从而提供了一种量化检测钙浓度变化的方法,即通过神经元在两个不同激发波长下所发射荧光的强度差异来判断。

大多数钙指示剂染料经过了进一步的修饰以使其易于穿透细胞膜,并被添加在神经元的培养液或注射到脑组织中用于整体动物的研究。

依照其有无结合钙离子,一些染料具有双激发或双发射的特性。例如Fura-2染料在有或无钙离子结合时具有不同的激发波长。通过计算它在两个激发波长时发光强度的比值,就可以更精确的判断钙离子浓度。

像Fura-2这样双激发或双发射的染料被称为荧光比率型钙指示剂。也有单一激发和发射波长的非荧光比率型染料,但它们更容易被光漂白,即长时间曝光会使其荧光减低或消失。

实验中使用染料前的一个关键步骤是对已知钙离子浓度的溶液中染料的荧光测量值进行校准。这使科学家们能够根据实验中测得的发射荧光强度来准确判断胞内钙离子的浓度。

现在,我们已经知道了钙指示剂是如何工作的,接下来让我们探讨如何在培养的神经元上进行钙成像检测。

首先准备选定的钙指示剂染料,如Fura-2,并将它与添加的生理溶液混合。旋涡振荡溶液,以保证混合充分。充分混合后,将其转入一个培养皿中。现在将培养有神经元的盖玻片放置在含染料溶液的培养皿中。接下来,在适当的温度下避光孵育神经元至所需的时间,这里是37℃下30分钟。孵育结束后,将盖玻片转移至不含染料的培养皿。

下一步是将盖玻片安装在显微镜的成像室上。一旦安装好,就连接上灌注系统的输入导管并慢慢地用溶液填充腔室。将腔室固定在显微镜的载物台上并安装输出灌注导管,确保溶液在整个灌注系统连续流动。

现在,显微镜平台准备好了,用可见光聚焦神经元。通过在340和380纳米的波长下照射细胞来测试染料。记得当用 Fura-2染料时,未激活的神经元在380 nm光激发时应发出更多的光,因为钙没有结合。

接着,在实验开始前,调整相机设置以优化动态范围。在每个波长采集一个图像,然后使用感兴趣区域或ROI工具来测量每个波长的背景强度。将背景值输入到控制软件中,以便背景值能从随后的图像中减去。

初始设置完成后,选择五个左右的视区成像并在控制软件中保存相应的参数。在实验过程中,显微镜自动平台移动到一个区域中,采集在340和380纳米波长光激发下的荧光比率,然后移动到下一个区域,直到所有的区域都被采集完。

在有些实验中,药理学试剂被加到灌流液中,引起细胞内钙水平的变化。高钾溶液能使神经元去极化,导致细胞内钙离子浓度上升,如图中这一系列延时拍摄的图像,就是一个很好的阳性对照。一旦数据采集完成,我们就开始进行分析。

要分析结果,我们先用软件选择包括神经元,或神经元部分结构的感兴趣区域(ROI区)。接下来,使用该软件在所有收集到的图像上测量每个ROI区在两种波长下的荧光强度比率。有了这个信息,就可以定量评估细胞内钙离子浓度随时间的变化。

现在您已经了解了如何对神经元进行钙成像,让我们来看看这种很有价值的方法在今天的科学研究中的一些应用。

首先,钙成像用于研究与神经活动有关的胞内钙动态。在这个研究中,单个神经元中被导入一种钙指示剂染料,并同时进行膜片钳记录。通过膜片钳技术精确控制膜电位,从而观察钙流动态。

钙成像使研究人员能够研究神经元的高度同步网络活动。

这里,神经科学家使用钙成像来检测40个神经元的荧光信号。有了这个信息,就可以确定信号传播、神经关系等网络特性。

钙动力学也可揭示神经元是如何处理来自外界的信号,如气味。

在这个实验中,组织内的神经元与Fura-2孵育,并在有类似尿液气味或纯化的信息素存在时进行成像。通过操纵嗅觉神经元上气味受体蛋白的表达,就可能直接可视化研究单个蛋白如何影响细胞对独特气味作出反应的能力。

您刚观看的是JoVE对神经元钙成像的介绍。本短片中,我们讨论了这项技术的特性,回顾了一个典型的实验。

由于钙具有很多重要功能,钙成像将持续作为了解神经元及其如何相互作用的重要工具。感谢观看!

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