Proyección de imagen de calcio en las neuronas

Neuroscience

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Summary

Los iones de calcio juegan un papel integral en función de la neurona: actúan como señales intracelulares que pueden provocar respuestas alteradas tales como genes y neurotransmisor lanzamiento de vesículas sinápticas. Dentro de la célula, la concentración de calcio es altamente dinámica debido a la presencia de bombas que transportan selectivamente estos iones en respuesta a una variedad de señales. Proyección de imagen de calcio aprovecha del flujo de calcio intracelular para visualizar directamente el calcio en las neuronas de la vida.

Este video comienza con una descripción de los reactivos claves usados para esta técnica, conocida como calcio indicador tintes. La discusión incluye una introducción a la tintura utilizada Fura-2 y algunos principios básicos cómo funcionan los indicadores de calcio proporcionales y no proporcionales. Luego, un calcio típico experimento de la proyección de imagen se presenta, de preparar las células y tinte para capturar y analizar las imágenes fluorescentes. Finalmente, se disponen de varias aplicaciones experimentales de la proyección de imagen de calcio, como el estudio de la actividad de la red neuronal y procesamiento sensorial.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la Neurociencia. Proyección de imagen de calcio en las neuronas. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Proyección de imagen de calcio es una técnica muy útil para investigar la variedad de roles que los iones de calcio tienen en funcionamiento las neuronas. Los iones de calcio generan una multitud de señales intracelulares que controlan las funciones claves, como la liberación del neurotransmisor desde las vesículas sinápticas. Métodos de proyección de imagen de calcio permiten la medición directa del flujo dinámico del calcio en neuronas y tejido neuronal. Este video ofrece una visión general de cómo indicador de calcio tintes trabajo, cómo un calcio experimento proyección de imagen se ha completado y finalmente discute algunas de las aplicaciones de esta técnica.

En primer lugar, revisemos los principios bioquímicos de calcio indicador tintes.

Calcio indicador colorantes son moléculas quelante modificado como Fura-2, que se componen de dos componentes principales. El primero es el sitio de quelante que une calcio de forma selectiva. El segundo es un sitio fluorescente que emite luz en una longitud de onda específica cuando es iluminado por una longitud de onda de excitación de la luz ultravioleta.

La fijación del calcio al medio altera sus propiedades de fluorescencia, que proporciona una manera de cuantificar los cambios en la concentración de calcio, que está representada aquí por la diferencia de intensidad fluorescente emitida por esta neurona de excitación diferentes dos longitudes de onda.

Más calcio indicador tintes más se modifican para que puedan atravesar fácilmente la membrana celular y son ya sea introducido en la solución del baño con las neuronas o inyectado en cerebro tejido para estudios de todo animal.

Algunos tintes tienen doble excitación o emisión dual propiedades dependiendo de si el calcio está limitado. Tomemos, por ejemplo, el tinte Fura-2, que tiene una longitud de onda de excitación diferentes al calcio está obligado frente a cuando no lo es. Tomando el cociente de la intensidad de emisión en las dos longitudes de onda de excitación, puede hacerse una estimación mucho más precisa de la concentración de calcio.

Tintes de excitación o emisión duales, como Fura-2, se llaman indicadores de calcio radiométrica. Existen tintes no proporcionales que tengan solo longitudes de onda de excitación y emisión. Sin embargo, son más susceptibles al fotoblanqueo, que es el debilitamiento o la pérdida de fluorescencia con exposición prolongada a la luz.

Un paso clave antes de usar un tinte en un experimento es calibrar las medidas de la fluorescencia del tinte con soluciones de concentraciones conocidas de calcio. Esto permitirá a los científicos a estimar con precisión las concentraciones intracelulares de calcio basadas en intensidades de emisión medidos durante los experimentos.

Ahora que hemos aprendido cómo funcionan los indicadores calcio, exploremos cómo flujo de calcio en las neuronas plateadas de la imagen.

Empezar por preparar el colorante indicador de calcio de elección, como Fura-2 y la mezcla con soluciones fisiológicas adicionales. La solución para asegurar una mezcla adecuada de vórtice. Transferencia una vez suficientemente mezclado en un plato. Ahora coloque el cubreobjetos con las neuronas cultivadas en el plato con la solución colorante. A continuación, incubar las neuronas en la oscuridad durante el tiempo requerido a la temperatura adecuada, que en este caso es 30 minutos a 37 ° c. Después de la incubación, transferir el cubreobjetos a un plato sin el tinte.

El siguiente paso es montar el cubreobjetos sobre la cámara de proyección de imagen del microscopio. Una vez montado, conecte la línea de entrada del sistema de perfusión y llenar lentamente la cámara. Fije la cámara en la platina del microscopio e instalar las líneas de perfusión de salida, asegurando un flujo continuo a través del sistema de perfusión.

Ahora que la platina del microscopio está lista, poner las neuronas en foco con luz visible. Prueba el tinte por iluminar las células en longitudes de 340 y 380 nm. Recordar que con Fura-2, las neuronas no activado deben emitir más luz cuando excitado por 380 nm ya que el calcio no está obligado.

A continuación, ajuste la configuración de la cámara con el fin de optimizar el rango dinámico antes de comenzar el experimento. Recoger una imagen a cada longitud de onda, luego use la región de interés o retorno de la inversión una herramienta para medir la intensidad de fondo en cada longitud de onda. De entrada los valores de fondo en el software de control para que puede restar de imágenes posteriores.

Una vez finalizada la configuración inicial, elija lo cinco campos de vista que debe ser reflejada para el experimento y guardar las coordenadas en el software de control. Durante el experimento automatizado etapa se traslada a un campo, recoge una relación de la intensidad de campo en longitudes de 340 y 380 nm y se mueve al siguiente campo hasta que se recogen todos los campos.

En algunos experimentos, un agente farmacológico se agrega al líquido de perfusión que provoca cambios en los niveles de calcio intracelular. Una solución de potasio alto, que despolarizan las neuronas, puede causar la concentración de calcio intracelular aumentando como se muestra en esta serie de lapso de tiempo de imágenes y sirve como un buen control positivo. Una vez completada la recogida de datos, proceder al análisis.

Para analizar los resultados, seleccione las regiones de interés que incluyen neuronas o partes de las neuronas mediante el software. A continuación, utilice el software para medir la imagen radiométrica intensidad información de ambas longitudes de onda en cada retorno de la inversión en todas las imágenes recogidas. Con esta información, se puede hacer una evaluación cuantitativa de los cambios en las concentraciones de calcio intracelular en el tiempo.

Ahora que tiene una comprensión de cómo se logra la proyección de imagen de calcio en las neuronas, Veamos algunas de las maneras de que este valioso método se aplica en la investigación hoy en día.

Primero y principal, proyección de imagen de calcio se utiliza para investigar cómo intracelular calcio fluxuates en relación con la actividad de los nervios.

En este estudio, las neuronas individuales se llenaron con un colorante indicador de calcio mientras graban abrazadera del remiendo. El control preciso de la membrana potencial de la técnica de patch-clamp proporciona una visión dinámica del flujo de calcio.

Proyección de imagen de calcio permite a los investigadores a investigar la actividad de red altamente sincrónica de las neuronas.

Aquí, neurocientíficos utilizan imágenes para evaluar la señal fluorescente de 40 neuronas de calcio. Con esta información, pueden determinarse las propiedades de la red como la propagación de las señales y las correlaciones neurales.

Dinámica del calcio también puede revelar cómo las neuronas procesan las señales del mundo exterior, como olores.

En este experimento, detección de feromonas órganos extraídos de una nariz de ratón fueron cultivados en cultura. Neuronas dentro del tejido se incubaron con Fura-2 y había reflejada mientras se presenta con olores como orina o purificaron de las feromonas. Manipulando la expresión de proteínas de receptor odorante en neuronas olfativas, es posible visualizar directamente cómo una única proteína influye en la capacidad de una célula para responder a los olores únicos.

Sólo ha visto la introducción de Zeus a la imagen de calcio en las neuronas. En este video, discutimos las propiedades de la técnica y había revisado un experimento típico.

Dado muchos papeles importantes de calcio, proyección de imagen de calcio seguirá siendo una herramienta vital en la comprensión de las neuronas y cómo interactúan entre sí.

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