Summary
Overview
Kalziumionen spielen eine wesentliche Rolle bei der Funktion von Neuronen: Sie fungieren als intrazelluläre Signale, die Reaktionen wie eine veränderte Genexpression und die Freisetzung von Neurotransmittern aus synaptischen Vesikeln hervorrufen können. Innerhalb der Zelle ist die Kalziumkonzentration hoch dynamisch aufgrund der Anwesenheit von Pumpen, die selektiv diese Ionen als Reaktion auf eine Vielzahl von Signale transportieren. Calcium-Imaging nutzt die Vorteile des intrazellulären Kalziumflusses, um die Signaltransduktion von Kalzium in lebenden Nervenzellen direkt sichtbar zu machen.
Dieses Video beginnt mit einer Übersicht der wichtigsten Reagenzien für diese Technik, die als Kalziumindikatorfarbstoffe bekannt sind. Der Überblick beinhaltet eine Einführung in den häufig verwendeten Farbstoff Fura-2 und einige Grundprinzipien wie die Beiden ratiometrischen und nicht-radiometrischen Kalziumindikatoren funktionieren. Als nächstes wird ein typisches Calcium-Imaging Experiment vorgestellt vom Vorbereiten der Zellen und des Farbstoffes bis zum Erfassen und Analysieren der Fluoreszenzbilder. Schließlich werden mehrere experimentelle Anwendungen des Calcium-Imaging bereitgestellt, wie die Untersuchung der neuronalen Netzwerkaktivität und die sensorische Verarbeitung.
Procedure
Calcium-Imaging ist ein äußerst nützliches Verfahren um die Vielzahl von Funktionen der Kalziumionen in funktionierenden Neuronen zu untersuchen. Kalziumionen erzeugen eine Vielzahl von intrazellulären Signalen, die Schlüsselfunktionen wie zum Beispiel die Freisetzung von Neurotransmittern aus den synaptischen Vesikeln steuern. Die Methoden des Calcium-Imaging ermöglichen eine direkte Messung des dynamischen Kalziumflusses in Neuronen und neuronalem Gewebe. Dieses Video gibt einen Überblick darüber, wie Kalziumindikatorfarbstoffe funktionieren, wie ein Calcium-Imaging Experiment abgeschlossen wird und schließlich werden einige der Anwendungen dieser Technik besprochen.
Zuerst wollen wir die biochemischen Grundlagen von Kalziumindikatorfarbstoffen besprechen.
Kalziumindikatorfarbstoffe sind modifizierte, chelatbildende Moleküle wie Fura-2, das aus zwei Hauptkomponenten zusammengesetzt ist. Der Erste ist die Chelator Seite, das Kalzium in einer selektiven Art und Weise bindet. Der Zweite ist eine fluoreszierende Seite, die Licht bei einer bestimmten Wellenlänge emittiert, wenn es mit einer Anregungswellenlänge im ultravioletten Bereich beleuchtet wird.
Die Bindung von Kalzium an den Farbstoff verändert seine Fluoreszenzeigenschaft, dies ermöglicht einen Weg die Veränderung der Kalziumkonzentration zu quantifizieren, das hier durch die Differenz der emittierten Fluoreszenzintensität des Neurons bei zwei verschiedenen Anregungswellenlängen dargestellt ist.
Die meisten Kalziumindikatorfarbstoffe sind weiter modifiziert damit sie die Zellmembran leichter durchschreiten können und in der Badlösung mit den Neuronen oder in das Gehirngewebe für Tierversuche eingeführt werden können.
Einige Farbstoffe haben Doppelanregungs- oder Dual-Emissionseigenschaften abhängig davon ob Kalzium gebunden ist oder nicht. Nehmen wir zum Beispiel den Farbstoff Fura-2 der eine unterschiedliche Anregungswellenlänge aufweist wenn Kalzium gebunden ist im Vergleich dazu wenn es nicht gebunden ist. Indem man das Verhältnis der Emissionsintensität bei beiden Anregungswellenlängen nimmt, kann eine viel genauere Kalkulation der Kalziumkonzentration erstellt werden.
Die Doppelanregungs- oder Emissionsfarbstoffe wie Fura-2 werden als ratiometrische Kalziumindikatoren bezeichnet. Nicht-ratiometrische Farbstoffe, die einzelne Anregungs- und Emissionswellenlängen haben, existieren auch. Allerdings sind sie anfälliger für die Photobleichung, die zur Schwächung oder zum Verlust der Fluoreszenz bei einer längeren Belichtung führt.
Ein entscheidender Schritt bevor man einen Farbstoff in einem Experiment verwendet, ist die Kalibrierung der Fluoreszenzmessungen des Farbstoffes mit Lösungen bekannter Kalziumkonzentrationen. Auf diese Weise können die Wissenschaftler die intrazelluläre Kalziumkonzentrationen basierend auf den gemessenen Emissionsintensitäten während des Experimentes genau bestimmen.
Zuerst wollen wir die biochemischen Grundlagen von Kalziumindikatorfarbstoffen besprechen.
Kalziumindikatorfarbstoffe sind modifizierte, chelatbildende Moleküle wie Fura-2, das aus zwei Hauptkomponenten zusammengesetzt ist. Der Erste ist die Chelator Seite, das Kalzium in einer selektiven Art und Weise bindet. Der Zweite ist eine fluoreszierende Seite, die Licht bei einer bestimmten Wellenlänge emittiert, wenn es mit einer Anregungswellenlänge im ultravioletten Bereich beleuchtet wird.
Die Bindung von Kalzium an den Farbstoff verändert seine Fluoreszenzeigenschaft, dies ermöglicht einen Weg die Veränderung der Kalziumkonzentration zu quantifizieren, das hier durch die Differenz der emittierten Fluoreszenzintensität des Neurons bei zwei verschiedenen Anregungswellenlängen dargestellt ist.
Die meisten Kalziumindikatorfarbstoffe sind weiter modifiziert damit sie die Zellmembran leichter durchschreiten können und in der Badlösung mit den Neuronen oder in das Gehirngewebe für Tierversuche eingeführt werden können.
Einige Farbstoffe haben Doppelanregungs- oder Dual-Emissionseigenschaften abhängig davon ob Kalzium gebunden ist oder nicht. Nehmen wir zum Beispiel den Farbstoff Fura-2 der eine unterschiedliche Anregungswellenlänge aufweist wenn Kalzium gebunden ist im Vergleich dazu wenn es nicht gebunden ist. Indem man das Verhältnis der Emissionsintensität bei beiden Anregungswellenlängen nimmt, kann eine viel genauere Kalkulation der Kalziumkonzentration erstellt werden.
Die Doppelanregungs- oder Emissionsfarbstoffe wie Fura-2 werden als ratiometrische Kalziumindikatoren bezeichnet. Nicht-ratiometrische Farbstoffe, die einzelne Anregungs- und Emissionswellenlängen haben, existieren auch. Allerdings sind sie anfälliger für die Photobleichung, die zur Schwächung oder zum Verlust der Fluoreszenz bei einer längeren Belichtung führt.
Ein entscheidender Schritt bevor man einen Farbstoff in einem Experiment verwendet, ist die Kalibrierung der Fluoreszenzmessungen des Farbstoffes mit Lösungen bekannter Kalziumkonzentrationen. Auf diese Weise können die Wissenschaftler die intrazelluläre Kalziumkonzentrationen basierend auf den gemessenen Emissionsintensitäten während des Experimentes genau bestimmen.
Da wir nun verstehen wie Calcium-Imaging in Neuronen ausgeführt wird, wollen wir uns einige der Möglichkeiten anschauen, wo diese wertvolle Methode in der heutigen Forschung angewendet wird.
Zuallererst wird Calcium-Imaging verwendet, um zu untersuchen, wie das intrazelluläre Kalzium in Bezug auf die neuronale Aktivität strömt.
In dieser Studie wurden einzelne Neuronen mit einem Kalziumindikatorfarbstoff gefüllt während sie mit dem Patch-Clamp-Verfahren aufgezeichnet wurden. Die genaue Kontrolle des Membranpotentials mit der Patch-Clamp-Technik bietet einen Einblick in die Dynamik des Kalziumflusses.
Calcium-Imaging ermöglicht Forschern die hochsynchrone Netzwerkaktivität von Neuronen zu untersuchen.
Hier verwendeten Neurowissenschaftler Calcium-Imaging um das Fluoreszenzsignal von 40 Neuronen zu berechnen. Mit diesen Informationen können Netzwerkeigenschaften wie die Signalausbreitung und die neurale Korrelationen ermittelt werden.
Die Kalziumdynamik kann auch deutlich machen wie Nervenzellen Signale von der Außenwelt wie Gerüche verarbeiten.
In diesem Experiment wurden Neuronen innerhalb des Gewebes mit Fura-2 inkubiert und abgebildet, während Geruchsstoffen wie Urin oder gereinigte Pheromone gegenwärtig sind. Durch die Manipulation der Expression der Geruchsrezeptorproteine in Geruchsneuronen, ist es möglich, direkt zu visualisieren wie ein einzelnes Protein die Fähigkeit einer Zelle, auf einzigartige Gerüche zu reagieren, beeinflusst.
Das war die JoVE Einführung zum Calcium-Imaging in Neuronen. In diesem Video haben wir über die Eigenschaften hinter der Technik und ein typisches Experiment besprochen.
Kalzium hat viele wichtige Aufgaben; Calcium-Imaging bleibt ein wichtiges Instrument für das Verständnis von Nervenzellen und wie sie miteinander interagieren. Danke für das Aufpassen!
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