齧歯類を用いた定位脳手術

Neuroscience

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Summary

定位脳手術は生きた動物の脳に操作を加えるための優れたテクニックです。脳アトラス(脳地図)を利用することで脳深部の標的への処置が可能となります。脳アトラスには、頭蓋骨の解剖学的ランドマークを基にした各領域の3次元座標値が記載されています。動物に麻酔をかけ頭部の毛を剃ったら、脳定位固定装置を呼ばれる特別な装置に保定します。この装置を利用することにより実験用ツールを目標座標に従い正確に配置することができます。定位脳手術は多用途であり、脳傷害モデルの作製や遺伝子発現を誘導することができる他、薬剤を脳に投与するために用いられます。

このビデオでは、定位脳手術の原理を解説しています。脳アトラスや固定装置の使い方、それに加えてプローブを配置する際の副尺の読み方を学ぶことができます。その後、定位脳手術に必須となる手順を解説しています。そして最後に、脳活動測定用の電気プローブの配置や脳組織の遺伝子操作など今日の研究への様々なアプリケーション例を紹介しています。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 神経科学のエッセンシャル. 齧歯類を用いた定位脳手術. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

定位脳手術は生きた動物の脳に操作を加えるための非常に優れたテクニックです。標的となる脳領域が脳の深部である場合、一般にその部位を目で確認することは困難です。

そこで空間の情報をもとに脳の様々な部位を標的とできるよう考案されたテクニックが定位脳手術です。

3次元座標を用いることにより、実験ツールを目的の脳部位に到達させ、脳活動の測定、損傷の誘発、遺伝子操作などを行うことができます。このビデオでは、定位脳手術の原理と必須となる処置の手順、そしてこのテクニックの様々なアプリケーションを紹介していきます。

詳しい手順の前に、このテクニックの基本原理と装置を紹介します。定位脳手術の際に重要となるのが、脳の標的領域の3次元座標上の位置です。

そのために脳アトラスつまり脳の地図が活躍します。アトラスとは染色した脳サンプルの連続切片を3次元で再構築したものです。

基準座標系とは、空間関係を以下の3軸で表す方法です。前後軸、左右軸、背腹軸になります。標的領域の位置を確認するために脳地図から適切な領域を見つけ出し、グリッドを使って一致する左右および背腹座標を計算します。前後座標はページの下か上に記載されています。

座標は頭蓋骨の各プレートが接する点である縫合部を基準として計測されます。最も重要となるのが、ブレグマと呼ばれる矢状縫合と環状縫合が交差する点です。

また、ラムダはそれよりも後方に位置し、矢状縫合がラムダ縫合と交差する点になります。

計測した位置に正確に操作を加えるために、脳定位固定装置を利用します。 この装置は主要パーツのマイクロマニピュレーターとマウンティングクランプに接続するためのプローブホルダーから構成されます。また門歯およびイヤーバーで動物の頭部を固定します。マイクロマニピュレーターにより手術用プローブの微細な調整が可能となり、副尺と呼ばれる補助目盛りにより3次元座標上の距離を精密に測定できるようになっています。

副尺の読み方ですが、まず左側の0の線が右側の目盛りのどこに位置しているのかを確認します。この目盛りの単位は10mmになっているので、1は10、2は20となります。ここでは0が10mmと11mmの間に位置しています。小数第一位の数字を確認するために、左の目盛りと右の目盛りが一直線上に並ぶ線を見つけます。左の目盛りを使ってこの値を読み取ります。ここでは9と読み取れますので、値は10.9mmということになります。

定位脳手術の原理の次は、処置の手順を見ていきましょう。処置開始前に動物に麻酔をかけ頭部の毛を剃って消毒しておきます。固定装置にマウスを保定するために、イヤーバーをゆっくりとマウスの耳に挿入し前歯を門歯バーに引っ掛けます。また角膜の乾燥を防ぐために眼軟膏剤を塗ってください。

メスで小さく切開し頭蓋骨を露出させます。筋組織を優しく切り離し表面をきれいにします。そしてマイクロマニピュレーターを使ってプローブをブレグマに向かって下げ、到達した点の背腹軸の値を記録しておきます。次にプローブを元に戻しラムダでも同様に作業します。ラムダとブレグマの高さの差が0.1mm以内であれば水平に固定されている状態です。その差が大きい場合は門歯バーの高さを調節し計測を繰り返してください。

水平状態になったところでブレグマに戻り左右軸と前後軸の値も記録します。脳アトラスから決定した目標座標を基にその部位までの距離を算出し、プローブを動かします。そして頭蓋骨に印をつけドリルで慎重に穴を開けます。頭蓋骨のすぐ下に硬膜が見えるはずです。この厚くしっかりとした膜は細い針の先端を使って優しく剥がしてください。

そしてマイクロマニピュレーターのアームを下げプローブを目的の背腹座標にセットしたら実験を開始していきましょう。

基本的な処置の手順を学んだところで、神経科学研究においてこの定位脳手術がどのように利用されているのか紹介していきます。

薬物を微細な脳領域に注入したいときに定位脳手術が大活躍します。トレーサーを注入して神経投射や結合性を可視化することや、化学物質や試薬を注入しニューロンの遺伝子を操作することができます。例えば、ウイルスを注入することで目的遺伝子を細胞に挿入することが可能となります。ここでは海馬にウイルスを注入しニューロンの一部にGFPを発現させています。反対に、ウイルスを利用しsiRNAを運搬させることで目的タンパク質の発現を抑制することもできます。ここでは定位脳手術後、側脳室にウイルスを注入しSOD1タンパク質の発現を抑制しています。

その他にも、脳に電極を設置し神経活動による電気信号を記録する実験にも定位脳手術が利用されます。処置を施した動物が回復したら電極を電気生理記録システムに接続し、動いている動物の脳内でのニューロンの発火を観察することができます。

神経活動の測定に加え、マイクロダイアリシス法にも定位脳手術が利用されます。このテクニックにより、薬物や神経伝達物質、覚醒動物の脳組織内の代謝産物濃度などを持続的にモニタリングできます。この実験では、先端に半透膜のついた小さなプローブに液体を満たし脳に埋め込みます。神経伝達物質やホルモン、薬剤を含む溶質が脳からプローブ内へと移動するのでそれを回収し解析します。ここではラットに空間的作業記憶のタスクを課したときの海馬のグルコース濃度を測定し局所的な神経活動を調べています。

ここまで定位脳手術についてご覧いただきました。このビデオでは、このテクニックの原理と手順、そして神経科学研究でのアプリケーション例を紹介しました。ご覧いただきありがとうございました。

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