Cultivo de explantes de tejido Neural

Neuroscience
 

Summary

La intrincada estructura del vertebrado sistema nervioso surge de una compleja serie de eventos que implica diferenciación celular, migración celular y cambios en la morfología de la célula. Estudio de estos procesos es esencial para nuestra comprensión de la función del sistema nervioso, así como nuestra capacidad para diagnosticar y tratar los trastornos que resultan de un desarrollo anormal. Sin embargo, los tejidos neuronales son relativamente inaccesibles para las manipulaciones experimentales, especialmente en los mamíferos embrionarios. Como resultado, muchos científicos aprovechan cultura explante para estudiar procesos de neurodesarrollo en un entorno "organotypic", lo que significa que se extirpa el tejido del organismo pero se mantiene su arquitectura celular compleja. Generalmente, explante culturas son creadas por disección cuidadosa del tejido neural que luego se sumerge en cuidadosamente había diseñado medios de cultivo y cultivo en vitro.

Este video primero proporcionará un breve resumen de la cultura de explantes neurales, incluyendo sus ventajas sobre otros métodos en vitro y consideraciones importantes para el mantenimiento de tejido sano. A continuación, se proporcionará un protocolo general para la creación de una cultura de explante de cerebro embrionario del ratón, sobre el aislamiento de los embriones de la madre y la disección del cerebro. La presentación también incluye una visión general del sector cultura, en el cual se generan secciones delgadas del tejido del sistema nervioso para un mejor acceso visual a las células en desarrollo. Por último, algunas aplicaciones de estas técnicas se prestará para demostrar cómo pueden ser utilizados para responder a preguntas importantes en el campo del neurodesarrollo.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la Neurociencia. Cultivo de explantes de tejido Neural. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Las culturas explant sirven como técnica para investigar el desarrollo de poblaciones celulares específicas y las estructuras neurales. En experimentos de desarrollo de la neurociencia, los explantes son tejidos neurales de un embrión de desarrollo continuo en vitro. Estas culturas dan a los investigadores la capacidad para manipular y visualizar los tejidos en desarrollo en formas que no son posibles en vivo. Este video presenta algunos principios importantes trabajando con tejidos explanted, procedimientos paso a paso para dos enfoques a la explantación de la cultura, así como aplicaciones de esta técnica.

Antes de profundizar en los métodos, permite repasar algunos principios básicos. Explantes se pueden establecer una serie de organismos modelo y una gran variedad de tipos de tejidos. En general, las culturas se crean cuidadosamente quitar tejido neural de un embrión, disección a una región de interés y colocarlo en un ambiente artificial.

Tejidos también pueden ser seccionados en láminas delgadas y crecidos en "sector cultura". Porque el ambiente de cultivo está diseñado para imitar las condiciones en vivo del órgano entero, esta estrategia de cultura a menudo se llama "organotypic."

Antes de comenzar, asegúrese de esterilizar sus instrumentos con etanol al 70%. A continuación, eutanasia un ratón embarazado utilizando el método preferido de su laboratorio. Entonces, quirúrgico suprimir el útero y en buffer helada. Transferir el plato a un microscopio de disección y quite su saco vitelino de embriones individuales. A continuación, aislar el cerebro cuidadosamente disecar hacia fuera de su país o región de interés y transferir a un plato de cultivo conteniendo medio de cultivo. Explantes se pueden mantener en una incubadora de 37 ° C con 5% CO2 durante unas semanas mediante la sustitución de 50% del medio cada 2-3 días.

Sector cultura de tejido cerebral requiere pasos adicionales. Antes de la corte, el tejido está incrustado en agarosa, que proporciona soporte a los tejidos por lo que permanece intacto mientras está siendo cortado. Para ello, se calienta una solución de agarosa de bajo punto de fusión de 1.5% hasta que la agarosa se disuelva. A continuación, la agarosa es había transferido a incrustar los moldes y dejar enfriar ligeramente para evitar dañar el tejido.

El tejido luego puede sumergir cuidadosamente y la agarosa dejado endurecer. Los bloques resultantes se recortan y luego pegan a un platina y seccionaron utilizando un vibratome, que es un instrumento que utiliza una cuchilla vibrante para cortar rebanadas finas de tejido vivo. Como rebanadas se generan, cuidadosamente se transfiere a una placa de recubrimiento que contienen medios de cultivo y cultivadas como se mencionó anteriormente.

Hay una serie de ventajas a usar las culturas explant sobre otros métodos en vitro y en vivo . En primer lugar, las células en el tejido explanted son más accesibles para las herramientas experimentales. En segundo lugar, el hecho de que los explantes mantengan la compleja arquitectura celular de desarrollar tejido neural significa que pueden estudiarse las interacciones célula-célula. En tercer lugar, puesto que pueden controlar la composición química del medio de cultivo, los científicos pueden utilizar explantes para probar el efecto de compuestos específicos en desarrollo de tejido.

Sin embargo, puesto que está siendo extraído de su entorno natural, especial debe tener cuidado para mantener el tejido sano y feliz en vitro. Por ejemplo, la presencia de matriz extracelular, o ECM, tiene un impacto significativo sobre el comportamiento de la célula, para que purificado proteínas ECM se utilizan a menudo para cubrir platos de cultura. Otra consideración importante es la solución en la que están bañados los explantes. Mientras que a menudo se utiliza medios de cultivo celular tradicional, algunos experimentos requieren soluciones que asemejan el fluido circulante en el sistema nervioso central: el líquido cefalorraquídeo, que es un reactivo importante en experimentos como los que están a punto de ver.

Ahora que hemos pasado más presentaron métodos de cultivo, vamos a ver cómo se utilizan estas técnicas.

Ensayos de migración de la célula utilizan tejido explanted para examinar las señales repulsivas y atractivas que participan en el movimiento celular neuronal. En este experimento, granos que han sido previamente empapados en factores de crecimiento son implantados en explantes de hindbrain para examinar la migración de la célula neuronal. Después de 3-4 días de exposición, las neuronas fueron fotografiadas utilizando un microscopio confocal. Los resultados muestran que las neuronas motoras migran hacia granos remojados en factor de crecimiento endotelial vascular, pero no controlar los granos remojados en solución tampón.

Ensayos de cocultivo se utilizan a menudo para investigar las interacciones célula-célula durante el desarrollo. En este ejemplo, los segmentos de la médula espinal fueron cultivados en la parte superior una capa de las células musculares para estudiar cómo se hacen las conexiones entre neuronas de motor espinales y músculo esquelético. Tan pronto como 2 días después de la incubación, las proyecciones de las neuronas, también conocido como neuritas, se ven de explante. Plazo de 5 días, inervación funcional se observa por la contracción de la capa de la célula muscular.

Durante el desarrollo del sistema nervioso, las neuronas deben alargar sus axones para establecer una conexión entre el tejido y el sistema nervioso central. Una manera de estudiar este proceso complejo es mediante ensayos de orientación axón. Los investigadores utilizan tejidos explanted para examinar los factores dentro de las neuronas y en el entorno que ayudan a orientar el axón en su ubicación correcta.

Sólo ha visto guía de Zeus para explante cultura del tejido neural. Este video cubre un resumen de las ventajas de las culturas explant, estrategias de cultura, paso a paso protocolos de dos procedimientos de explante utilizados y formas que estas técnicas se utilizan en el laboratorio de hoy.

¡Gracias por ver!

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