Primäre neuronale Kulturen

Neuroscience

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Summary

Die Komplexität des Gehirns fordert häufig Neurowissenschaftlern, ein einfacheres System für experimentelle Manipulationen und Beobachtungen zu verwenden. Ein leistungsfähiger Ansatz ist die Entwicklung einer Primärkultur durch das Sezieren des Gewebes des Nervensystems, das Dissoziieren in einzelne Zellen und das Wachsen dieser Zellen in vitro. Primärkulturen machen Neuronen und Gliazellen leicht für die experimentellen Instrumente zugänglich, die für Techniken wie die genetische Manipulation und Zeitraffer-Aufnahmen erforderlich sind. Außerdem stellen diese Kulturen eine gut steuerbare Umgebung dar, in der komplexe Phänomene wie Zell-Zell-Interaktionen untersucht werden können.

Dieses Video gibt einen Überblick über die wichtigsten Schritte bei der Herstellung von primären neuronalen Kulturen, die die Auswahl und die Zerlegung des Gewebes von Interesse, den mechanischen und chemischen Abbau des Gewebes, um eine Einzelzellsuspension herzustellen, das Ausplattieren der Zellen und die Erhaltung der Kulturen in dem entsprechenden Medium bereitstellt. Mehrere Beispiel Experimente werden vorgestellt, um zu zeigen, wie Zellkulturen verwendet werden können, um den Proteintransport, die morphologischen Veränderungen und die Elektrophysiologie in lebenden Nervenzellen zu untersuchen.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Grundlagen der Neurowissenschaften. Primäre neuronale Kulturen. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Das Gehirn ist eines der kompliziertesten Organe im Körper deswegen benötigen Neurowissenschaftler oft ein einfacheres System für experimentelle Manipulationen und Beobachtungen. Die Zellkultur ist ein solches System, das einen einfachen Zugang zu lebenden Nervenzellen ermöglicht. Im Allgemeinen umfasst die Kultivierung von Zellen das Wachsen der Zellen in speziellen Lösungen, die Kulturmedien genannt werden, in einem sterilen, kontrollierbaren Umfeld - in der Regel ein warmer Inkubator. Eine Primärkultur ist eine, die aus seziertem Gewebe eines Organismus hergestellt wird. Verschiedene Arten von primären neuronalen Kulturen können aus einer Vielzahl von Organismen, Entwicklungsstufen und Geweben des Nervensystems hergestellt werden.

Das Video wird eine Einführung in das Verfahren zur Herstellung von primären neuronalen Kulturen und einige Experimente, die häufig diese Zellen verwenden, bereitstellen.

Viele der Tier-Modelle, die wichtig für die neurowissenschaftliche Forschung sind, können für die Vorbereitung von primären neuronalen Kulturen verwendet werden. Bei Mäusen und Ratten - zwei der am häufigsten verwendeten Säugetiere in der biomedizinischen Forschung - kann Nervengewebe aus Embryonen, neugeborenen Jungtieren und Erwachsenen für die Kultivierung seziert werden. Embryos und perinatale Jungtiere werden typischerweise bevorzugt, da die Gehirnzellen unreif und weniger anfällig für Beschädigungen sind.

Verschiedenes Gewebe des Nervensystems kann isoliert und für die Herstellung von verschiedenen Arten von primären neuronalen Kulturen verwendet werden. Beispielsweise können bestimmte Teile des Gehirns seziert werden, wie etwa das Kleinhirn, der Kortex und der Hippokampus. Das Rückenmark oder Komponenten des peripheren Nervensystems, wie die Dorsalwurzelganglien können auch präpariert und kultiviert werden, um spezifische Typen von Neuronen zu züchten.

Unabhängig von der Gewebequelle kann das allgemeine Verfahren zur Herstellung von primären neuronalen Kulturen in ein paar wichtigen Schritten zusammenfassen werden: Präparierung, Dissoziation, Ausplattierung und Aufrechterhaltung.

Beginnen wir mit einer gründlichen Besprechung dieser Schritte, beginnend mit dem Ersten: Präparierung. In der Vorbereitung für die Schritte der Präparation und Kultivierung ist Sterilität entscheidend, um Kontamination der Kulturen zu verhindern. Instrumente müssen mit Alkohol sterilisiert werden und eine Sterilbank mit Laminarströmung wird oft verwendet, um Verunreinigungen aus der Luft zu entfernen.

Für die Kultivierung von Nagetierneuronen sollte das Gewebe von frisch getöteten Tieren entfernt und in eine kalte, gepufferte Salzlösung transferiert werden. Mit einem Stereomikroskop können kleinere Teile des Gewebes - wie der Hippokampus - vorsichtig für die Weiterverarbeitung isoliert werden.

Als Nächstes ist es notwendig, die Probe in ihre Zellbestandteile, in einem Prozess bekannt als Dissoziation, aufzuschließen. Das sezierte Gewebe wird zuerst mit einem Skalpell oder einer Schere zerkleinert. Die erhaltenen Gewebestücke werden dann in einen neuen Behälter transferiert. Ein proteolytisches Enzym wie Trypsin oder Papain wird dann hinzugefügt, um die extrazellulären Matrixproteine, die die Zellen miteinander verbinden, zu verdauen. Nach einer kurzen Inkubation in einem warmen Inkubator oder Wasserbad werden die Gewebestücke vorsichtig mit einem Puffer gewaschen, um die Enzyme zu entfernen.

Die enthärteten Gewebestücke können nun durch Verreiben dissoziiert werden, dies beinhaltet, das das Gewebe mehrmals in einer Pipette gezogen wird, sodass die Zellen in eine Einzelzellsuspension gelöst werden. An diesem Punkt können die Zellen für die Konzentration gezählt und auf die Lebensfähigkeit mit Farbstoffen wie Trypanblau geprüft werden, die helfen zu bestimmen, wie viel die Suspension für ein erfolgreiches Wachstum verdünnt werden sollte.

Endlich sind die Nervenzellen bereit für die Kultivierung! Nun wollen wir einige wichtige Maßnahmen besprechen, die notwendig sind, um sie am Leben und gesund zu halten. Die Zusammensetzung des Kulturmediums, das verwendet wird um die Nervenzellen zu züchten, ist sehr wichtig. Spezielle Zusätze, die das neuronale Überleben und Wachstum unterstützen, werden in der Regel zu dem Medium gegeben. Weitere Zusatzstoffe können Medikamente umfassen, die die Teilung von nicht-neuronalen Zellen inhibieren, wie die Gliazellen.

Nachdem die neuronale Zellsuspension mit dem Medium gemischt wird, sind die Zellen bereit um in den gewünschten Gefäßen ausplattiert zu werden. Diese können Kulturschalen und Platten oder Deckgläser in diesen Behältern einschließen. Da Nervenzellen nicht direkt auf Glas wachsen können, werden die Deckgläschen vorher behandelt, um eine bessere Oberfläche für die Zellhaftung und Wachstum zu schaffen. Diese Behandlungen können das Beschichten mit synthetischen extrazellulären Matrixproteinen zum Beispiel Polylysin und Laminin oder Säureätzung, um die Oberfläche aufzurauen, enthalten.

Wenn die Neuronen ausplattiert sind, werden sie in einem warmen, feuchten Inkubator gezüchtet. Das Wachstum der neuronalen Prozesse kann innerhalb von Stunden bis zu Tagen beobachtet werden. Um die Kulturen aufrechtzuerhalten, wird ein Teil des Kulturmediums mit frischem Medium, etwa einmal pro Woche, ausgetauscht. Typischerweise werden primäre neuronale Kulturen für Experimente überall von einigen Tagen bis zu einigen Wochen nach der Beschichtung verwendet.

Da wir nun Neuronen in Kulturen wachsen haben, was können wir mit diesen Zellen tun?

Eine grundlegende Methode, die häufig bei neuronalen Kulturen angewendet wird, ist die genetische Manipulation durch Transfektion oder virale Transduktion. Zum Beispiel kann bei der genetische Materialkodierung ein mutiertes Protein in die kultivierten Neuronen eingeführt werden, um die neuronale Funktion zu verändern. Alternativ ist die Transfektion mit doppelsträngiger RNA eine effektive Technik zum Blockieren der Proteinexpression. Die Verfügbarkeit von mehreren Verfahren und Reagenzien für die genetische Manipulation machen dieses Verfahren zu einer besonders wertvollen Anwendung für eine breite Vielfalt von Forschungsfragen.

Eine Beispiel Frage, die mit Transfektionen in neuronalen Kulturen adressiert werden kann, ist: Wie und wo werden bestimmte Proteine oder Proteinkomplexe zu verschiedenen morphologischen Strukturen des Neurons transportiert? Um die Antwort zu erhalten, werden Neuronen mit DNA, die das Protein von Interesse codiert, die mit einem fluoreszierenden Protein fusioniert werden kann, wie zum Beispiel grün fluoreszierendes Protein oder GFP, transfiziert. Die Bewegungsabläufe und die Lokalisation des fluoreszenzmarkierten Proteins kann dann mit der Echtzeit-Bildgebung überwacht werden. Dieses Verfahren kann verwendet werden um beispielsweise den Transport von Neurotransmitter-Rezeptoren zu der Zelloberfläche zu untersuchen.

Primäre neuronale Kulturen sind auch sehr nützlich für die elektrophysiologischen Untersuchungen, in denen die elektrische Aktivität einzelner Zellen unter Verwendung von Mikroelektroden gemessen werden kann. Die Einzelschicht von Neuronen in einer Kultur bedeutet, dass einzelne Zellen eine leichte Zielscheibe sind und Manipulationen, wie pharmakologische Behandlungen sind schnell und gleichmäßig aufgetragen. Beispielsweise kann die Wirkung einer Testverbindung auf die Aktivität eines einzelnen Neurons mit der Patch-Clamp-Technik in kultivierten Neuronen gemessen werden.

Das war die JoVE Einführung zu primären neuronalen Kulturen. In diesem Video haben wir gezeigt, wie diese Kulturen hergestellt werden und die Arten von Experimenten, bei denen sie häufig verwendet werden. Primäre neuronale Kulturen können aus einer Vielzahl von Gewebequellen hergestellt werden, typischerweise unter Verwendung eines Verfahrens, das Dissektion, Dissoziation in eine Zellsuspension und das Wachsen in Kulturmedium in Inkubatoren beinhaltet. Danke für das zuschauen!

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