神经元转染方法

Neuroscience

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Summary

转染–将遗传物质转入细胞的过程 - 是一个快速和有效改变细胞中基因表达操作的功能强大的工具。因为转染可用于沉默特定蛋白质的表达或驱动外源或修饰蛋白质的表达,它在研究支配神经元功能的细胞和分子进程中极其有用。然而,成熟的神经元有许多特性,使它们难以被转染,因此需要专门的技术来遗传操作这种细胞类型。

本短片讲述了转染神经元的原理和理论依据。讨论了神经元转染的三种常见的方法,其中包括核转染,基因枪,和病毒转导。除了描述这每个技术是如何克服神经元转染中的障碍,短片还对如何操作这三种方法进行了说明。最后,短片介绍了神经元转染的多种应用,例如表达荧光标记的管蛋白使得可对神经元的形态进行观察,还可通过选择性基因沉默来产生帕金森氏病的细胞培养物模型。

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JoVE Science Education Database. 神经科学的基本知识. 神经元转染方法. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

转染-即将遗传物质转入哺乳动物细胞内 - 是一个能让科学家们遗传操作神经元和神经组织的有用工具。神经元细胞脆弱的特质使得对它的转染具有挑战性并需要专门的技术。本短片将回顾转染神经元背后的原理,在这些细胞上常用的转染手段,包括核转染,基因枪转染和病毒转导。最后,我们将讨论转染技术在细胞和分子神经科学研究中的应用。

让我们首先来回顾转染是如何工作的。尽管遗传物质可以被添加到培养细胞周围的培养液中以接近细胞,但核苷酸却不能有效地渗透细胞膜。

所有转染方法的目的都是使遗传物质绕过这个障碍。阻止蛋白质合成的核苷酸,如沉默RNA,一旦进入到细胞质中便能立即行使其功能。但是,DNA形式的载体必须被运送到细胞核内进行翻译,之后蛋白质合成才能开始。在分裂的细胞中,核膜在有丝分裂过程中的破裂会导致转染的DNA整合进子细胞的细胞核。由于多数培养的神经元是有丝分裂后 – 即非分裂的细胞,要成功地诱导基因表达就需要专门的转染方法。

让我们从核转染开始来介绍这些方法。该技术结合使用感应电场和化学试剂,它们的共同作用会在胞膜和核膜上产生瞬时,孔状的结构。由于核苷酸带电荷,电场还将驱动DNA运动通过小孔。

为了完成这一过程,先通过离心将悬浮液中的神经元沉淀下来,再重悬于商品化的核转染试剂中。然后将细胞混合物与纯化的DNA混合,转移到一个电击杯中,电击杯有两块铝板,能与核转染装置产生电流接触。该装置能提供一系列快速的电脉冲,其数量和持续时间都可以根据细胞类型设置。核转染后,可用培养液将细胞稀释并铺板继续培养。

此外,基因枪技术能通过爆冲穿透转染屏障,将携带遗传物质的子弹射穿通过细胞和核膜。

要制作基因枪子弹,需将编码感兴趣基因的DNA沉淀到微米级大小的金颗粒上。孵育10分钟后,洗涤颗粒并转移至管中。然后,管子一边旋转一边干燥溶液,这就产生了均匀涂层的颗粒。接下来,将管子切割成弹药筒并装入枪中。简单的扣动扳机,就可通过气驱动将遗传载体打入生长在标准培养板的细胞中。

最后,病毒转导利用病毒生活周期的优点来将外源遗传物质转入细胞核。将编码目的基因的RNA包装进改造过的逆转录病毒,即所知的慢病毒载体中,该病毒载体通过与特定的膜蛋白结合,引发膜融合事件,从而进入靶细胞。病毒RNA然后被逆转录成互补DNA链,被输送到细胞核中。

在开始操作前,要注意病毒也能象感染培养皿中的细胞一样感染您身体的细胞,因此遵守安全准则非常重要。

第一步是生成携带目的基因的慢病毒颗粒。这是通过在适合病毒繁殖的人细胞系,如293T细胞中表达病毒的构建模块来完成。为避免工程病毒的不必要传播,病毒装配所需的基因被与转移载体分开,转移载体的序列将被包括在感染性病毒颗粒中。大约2天后完全组装的病毒被释放到培养液中,这样它们可以通过超速离心被收集和浓缩。然后通过成功转导测试细胞系来确定病毒的适当浓度或滴度。慢病毒载体接下来被加入到目标神经元培养物中,通常培养24至48小时,以确保发生感染。

现在,您已经熟悉了常用的转染技术,您可根据您实验的具体目的选择使用哪种技术。让我们来看一些例子。

首先,观察培养中神经元的成熟使得能详细分析对神经元的连接很重要的形态变化,如树突棘的形成。为观察细胞形态随时间的变化,研究人员利用核转染的方法将荧光蛋白转入培养的神经元中。在这里,荧光标记的微管蛋白被转染进一种细胞亚类中,从而可以通过荧光显微镜详细分析细胞突起。因为表达水平可在整个神经元的生存期保持,形态学分析可在培养物中进行至少一个月。

转染还可以用于测试特定的基因突变对神经元功能的影响。基因枪可用于输送编码蛋白质的野生型或突变型的DNA,其在细胞生物学上的短期影响可被我们进行评估,例如使用膜片钳来记录神经元的发放。

最后,测试基因功能的一个常用的手段是观察当某个基因的表达被阻断时细胞会怎样。为进行这些实验,可使用慢病毒载体转入沉默RNA载体,它能阻止蛋白质的合成。在这个实验中,与帕金森氏症相关的基因的敲除导致细胞活力显著下降。

您刚观看的是JoVE对神经细胞转染的介绍。本短片中,我们介绍了神经元转染的原理,操作步骤以及三种常见的转染方法的应用。感谢观看!

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