Métodos de transfección neuronal

Neuroscience

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Summary

-El proceso de transferencia de material genético en las células - la transfección es una poderosa herramienta para la manipulación rápida y eficaz de la expresión génica en las células. Porque este método puede utilizarse para silenciar la expresión de proteínas específicas o a la expresión de las proteínas extranjeras o modificadas, la transfección es una herramienta extremadamente útil en el estudio de los procesos celulares y moleculares que gobiernan la función neuronal. Sin embargo, las neuronas maduras tienen un número de propiedades que los hacen difíciles de transfectar, técnicas especializadas son necesarias para la manipulación genética de este tipo celular.

Este vídeo repasa los principios y fundamento de transferencia de las neuronas. Tres estrategias comunes para transfección neuronal se discuten, incluyendo nucleofection, gene-gun y transducción viral. Además de describir cómo cada una de estas técnicas supera los desafíos asociados con la transferencia de las neuronas, la presentación incluye una descripción de cómo se realizan los tres métodos. Por último, se introducen varias aplicaciones de la transfección neuronal, como la expresión de proteínas de tubulina fluorescente para visualizar la morfología de la neurona y para generar un modelo de cultivo celular de la enfermedad de Parkinson que silencian el gen selectivo.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la Neurociencia. Métodos de transfección neuronal. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

-La transferencia de material genético en las células mamíferas - la transfección es una valiosa herramienta que permite a los científicos a manipular genéticamente las neuronas y tejido neuronal. Las propiedades únicas de las células delicadas hacen transfección difíciles y requieren de técnicas especializadas.

Este video revisaremos los principios detrás de transfectar las neuronas y presentar estrategias comúnmente utilizadas en estas células, incluyendo nucleofection, biolística transfección y transducción viral. Finalmente, se discuten aplicaciones de las técnicas de transfección en investigación de Neurociencia molecular y celular.

Vamos a empezar por revisar cómo funciona la transfección. Mientras que el material genético se puede entregar en proximidad cercana a un cultivo de células añadiendo al medio circundante, nucleótidos eficiente no pueden penetrar las membranas celulares.

Todos los protocolos de la transfección están diseñados para que el material genético pasar esta barrera. Nucleótidos que bloquean la producción de proteínas como el silenciamiento de RNA, inmediatamente pueden realizar su función una vez que entran en el citoplasma. Sin embargo, construcciones de ADN deben ser transportadas en el núcleo de traducción antes de empezar la síntesis de proteínas.

En dividir las células, la ruptura de la envoltura nuclear durante la mitosis puede resultar en la incorporación de DNA transfected en reformar los núcleos de célula hija. Porque más cultivadas las neuronas son las células post mitóticas - o no se dividen -, protocolos de la transfección especializados se requieren para inducir con éxito la expresión génica.

Vamos a empezar nuestro Resumen de estos protocolos con nucleofection. Esta técnica utiliza una combinación de un campo eléctrico inducido y reactivos químicos, que actúan juntos para crear transitoria, poro-como las estructuras celulares y las membranas nucleares. Puesto que los nucleótidos están cargados, el campo eléctrico también unidades de movimiento de ADN a través de los poros.

Para llevar a cabo este procedimiento, las neuronas en suspensión se recogen en un pellet por centrifugación antes de resuspensión en comercial nucleofection reactivo. La mezcla de células después se combinan con el ADN purificado y transferida a una cubeta de electroporación, que dos placas de aluminio características eléctricas que en contacto con el aparato de Nucleofector. Este dispositivo ofrece una serie de pulsos eléctricos rápidos, cuyo número y duración son personalizados según el tipo de célula. Después nucleofection, las células pueden ser diluidas en medio de cultivo y plateadas para un crecimiento continuo.

Por otra parte, la técnica de la pistola de genes explosiones a través de las barreras de la transfección, disparando balas de llevar material genético a través de celulares y las membranas nucleares.

Para hacer balas de pistola de genes, ADN codifican el gen de interés se precipita en granos de la escala del micrón, compuestos generalmente de oro. Después de una incubación de 10 minutos, los granos son lavados y transferidos en la tubería. Continuación, se gira el tubo como la solución seca, resultando en una capa uniforme de cuentas. A continuación, el tubo es cortar cartuchos y cargado en la pistola. Gasolina la entrega de la carga genética se puede realizar en células de cultivo en placas de cultivo estándar por una simple presión sobre el gatillo.

Por último, transducción viral aprovecha el ciclo de vida viral para entregar material genético extraño en el núcleo. RNA que codifican el gen de interés se empaqueta en retrovirus modificados conocidos como vectores lentivirales, que entrar en las células diana por Unión a las proteínas de membrana específicas, desencadenar un evento de fusión de la membrana. El RNA viral es reverso transcribe en una hebra de ADN complementaria que se transporta en el núcleo.

Antes de comenzar este procedimiento, tenga en cuenta que virus pueden infectar las células en su cuerpo, así como los de tu plato, así que siguiendo las directrices de seguridad es extremadamente importante.

El primer paso es generar las partículas lentivirales portadores tu gen de interés. Esto se logra expresando los bloques de edificio del virus en una línea de células humanas optimizada para la producción viral, como las células 293T. Para evitar la propagación innecesaria de virus modificados, los genes necesarios para su montaje se mantienen separados de los vectores de transferencia, cuya secuencia se incluirá en la partícula infecciosa.

Tarda unos 2 días para los virus completamente montados ser liberados en el medio de cultivo, donde puede ser recogidos y concentrados por ultracentrifugación. A continuación, la concentración adecuada, o título, de virus se determina evaluando el éxito de la transducción de señales en una línea celular de prueba. Los vectores lentivirales es entonces agregado a la cultura neuronal y normalmente se incuba durante 24 a 48 horas asegurar que la infección ha ocurrido.

Ahora que usted está familiarizado con las técnicas de transfección comunes, que usted utilice dependerá de los objetivos específicos de los experimentos. Echemos un vistazo a algunos ejemplos.

Para empezar, observar que la maduración de las neuronas en cultivo permite un análisis detallado de los cambios morfológicos que son importantes para la conectividad neuronal, como la formación de espinas dendríticas. Para visualizar la morfología celular con el tiempo, estos investigadores hicieron uso de nucleofection para entregar una proteína fluorescente en cultivan las neuronas. Aquí, una proteína tubulina fluorescente etiquetado fue transfected en un subconjunto de las células, lo que permite análisis detallados de los procesos celulares mediante microscopía de fluorescencia. Porque los niveles de expresión se mantuvieron a lo largo de la vida de la neurona, se podrían realizar análisis morfológico para al menos un mes en la cultura.

Transfección puede utilizarse también para probar el impacto de las mutaciones genéticas específicas en función de la neurona. Una pistola génica puede utilizarse para entregar ADN codificación de tipo salvaje o versiones mutantes de una proteína, y los impactos a corto plazo en la biología celular pueden evaluarse, por ejemplo por la grabación de abrazadera del remiendo de leña de la neurona.

Por último, una estrategia común para las pruebas de función del gen es observar lo que sucede a las células cuando se bloquea su expresión. Para estos experimentos, vectores lentivirales pueden utilizarse para ofrecer construcciones silenciamiento de RNA, que impiden la síntesis de proteínas. En este experimento, knockdown de genes asociados con la enfermedad de Parkinson lleva a una disminución significativa en la viabilidad celular.

Sólo ha visto la introducción de Zeus para transfección de las neuronas. En este video hemos introducido principios de transfección de la neurona, así como los procedimientos y aplicaciones para tres estrategias comunes de transfección.

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