Gen-Silencing mit Morpholinos

Developmental Biology

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Summary

Morpholino-vermittelte Gen-silencing ist eine verbreitete Methode, Rollen bestimmter Gene während der Entwicklung zu studieren. Morpholinos hemmen Genexpression durch Hybridisierung zu ergänzenden mRNAs. Aufgrund ihrer einzigartigen Chemie sind Morpholinos einfach zu produzieren und zu speichern, wodurch sie besonders kostengünstig im Vergleich zu anderen Gen-silencing Methoden.

Dieses Video Bewertungen richtige experimentelles Design, wenn diese Oligonukleotide mit. Danach eine Erklärung der Morpholino Mikroinjektion Techniken im Zebrafisch und die Analyse der resultierenden Phänotypen erörtert werden. Zu guter Letzt präsentieren wir Beispiele für spezifische Anwendungen wo Morpholino Technologie, Entwicklungsstörungen zu modellieren oder Geweberegeneration zu studieren verwendet wird.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Grundlagen der Entwicklung Biologie. Gen-Silencing mit Morpholinos. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Gen-Silencing-Techniken sind auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie gebräuchlich. Morpholino Knockdown Ansätze erlauben routinemäßig Forscher zu identifizieren und zu charakterisieren, Gene wichtige zelluläre Prozesse beteiligt. Antisense Morpholinos sind jetzt sehr beliebt in vielen Modellsystemen, einschließlich Mäuse, Küken und Zebrafisch, durch ihre hohe Wirksamkeit, hohe Spezifität und niedrige Kosten.

Dieses Video bietet einen Überblick Morpholino Mechanismen und Strategien der Mikroinjektion, experimentelle Schlüsselkontrollen und wie Morpholinos in Laboren heute verwendet werden, um vertebrate Entwicklung zu untersuchen.

Morpholinos entstanden zunächst als eine Möglichkeit, die Übersetzung von RNA-Transkripte in lebenden Zellen und Organismen zu hemmen. Im Allgemeinen sind Morpholinos synthetische Moleküle bestehend aus 25 Oligonukleotide durch ein neutral geladenen Backbone verbunden.

Aber obwohl Morpholinos DNA viel aussehen kann, sie enthalten Morpholine Ringe anstelle der Zuckergruppen in Phosphat Zucker Rückgrat gefunden. Diese einfache Konvertierung Morpholino Stabilität in den Zellen erhöht und senkt ihre Kosten der Produktion.

Innerhalb der Zellen werden Morpholinos auf die RNA von Interesse durch komplementäre Basenpaarung ausgerichtet. Die Lage auf der RNA wo die Morpholino hybridisiert bestimmt seine spezifischen Wirkmechanismus.

Spleiß-blocking Morpholinos binden an spezifische Kreuzungen und ordnungsgemäße Niederschrift Verarbeitung, während Übersetzung-blocking Morpholinos innerhalb der 5' unübersetzte Region des Gens in der Nähe der translationalen Startsite binden und verhindern, Ribosom Versammlung dass zu hemmen. Beide Arten von Morpholinos reduzieren Ausdruck des funktionalen Zielproteine.

Bei der Planung ein Experiment mit Morpholinos gibt es ein paar wichtige Aspekte im Auge zu behalten. Morpholinos kann in mehreren Modellsystemen verwendet werden, daher es wichtig ist, ein Modell auszuwählen, die in der Lage ist, die biologische Frage auf der hand.

Morpholinos sind kommerziell synthetisiert, sollte und professionelle Design-Unterstützung gibt es ohne Kosten für Forscher, weil sie Sequenz-spezifische sind, gen-Informationen für alle spezifischen Morpholino Ziele jedoch aus der Region vor dem design.

Oft gibt es im Zebrafisch Modellsystem zwei Kopien einzelner Gene, die in anderen Wirbeltieren, aufgrund einer Vollständiggenom Vervielfältigung Ereignis in einem evolutionären Vorfahren der Zebrafisch gefunden. Daher kann Knockdown von beiden Zebrafisch-Gene erfolgreich Modell Protein Mängel in der menschlichen Entwicklung erforderlich.

Gute experimentelle Kontrollen zu entwerfen ist genauso wichtig wie Ihre gezielte Morpholinos entwerfen. Alle angegebenen Morpholino kann spezifische Sequenzen auf verschiedene Gene binden. Es ist ratsam, unabhängige, nicht-überlappende Morpholinos ergänzen das gleiche gen zu verwenden, um sicherzustellen, dass eine beobachteten phänotypische Veränderung durch Knockdown von Ihrem gen von Interesse ist.

Nun, da wir Morpholino Versuchsanordnung behoben haben, lassen Sie uns schauen Sie sich wie Morpholinos in Zebrafisch eingebracht werden.

Hier beschreiben wir Morpholino Mikroinjektion in Zebrafisch. Für weitere Einblicke und Anleitung über die Einzelheiten der Mikroinjektion unter dem Titel bitte Referenz Jupiter Science Education video "Zebrafisch Mikroinjektion Techniken."

Morpholinos sind in der Regel in Zebrafisch-Embryonen zwischen den - und vier-Zell-Stadium, in das Eigelb injiziert oder Zelle Zytoplasma. Zytoplasmatischen Verbindungen zwischen embryonalen Zellen ermöglichen schnelle Verbreitung und allgegenwärtige Bereitstellung von wasserlöslichen Morpholinos im gesamten Organismus. Morpholinos sind stabil in den Zellen, da die Zebrafish Embryos bei 28,5 ° c angehoben wird

Optimale Einspritzung Konzentrationen und Mengen müssen für jede Morpholino empirisch getestet werden. In der Regel ist die niedrigste Dosis, die bei der gibt es ein definierter zuverlässige Phänotyp in mindestens 50-75 % der injizierten Embryonen verwendet, um embryonale Tödlichkeit oder Ziel Nebenwirkungen zu vermeiden.

Die meisten Morpholino Zebrafisch Phänotypen werden in den ersten drei Tagen nach Befruchtung identifiziert, und Gen-silencing ist in der Regel wirksam durch Tag fünf. Bei Splice-blocking Morpholinos kann RT-PCR zur relative Mengen der einheimischen und veränderte Abschriften zu identifizieren. Für Übersetzung-blocking Morpholinos können Ebenen der gen-Knockdown von Western-Blot beurteilt werden.

Die rasante äußere Entwicklung und Transparenz der Zebrafisch-Embryonen ermöglicht einfache Beobachtung der vielen frühen biologischen Prozessen. Morpholino Phänotypen können häufig durch die Analyse der Morphologie mit Hellfeld oder Fluoreszenz-Mikroskopie, sowie durch die Beurteilung von Verhalten gewertet.

Nachdem der Morpholino Phänotyp definiert wurde, kann RNA Rettung durchgeführt werden, um Ziel-Spezifität demonstrieren. Nach Morpholino Knockdown von endogenen mRNA ist synthetisches mRNA injiziert, die das gleiche Protein kodiert, aber enthält keine Morpholino Zielsequenz. Ist diese injizierten RNA, den Wildtyp Phänotyp des Organismus wieder herzustellen, können wir feststellen, dass die beobachteten Morpholino-Phänotyp ist speziell durch das Zielgen abgerissen bekommen.

Jetzt haben Sie eine Gefühl für was Morpholinos sind und wie kontrollierte Morpholino Experimente durchgeführt werden können, lassen Sie uns betrachten wie Morpholinos in biologischen Laboren heute umgesetzt werden.

In der Zellbiologie werden Morpholinos zur frühen Entwicklungsprozessen zu verstehen. Zilien erzeugte Strömung in Kupffer Vesikel ist ein Beispiel, das rechts-links-Muster im Zebrafisch steuert. Strömung verläuft gegen den Uhrzeigersinn in Kontrolle injiziert Embryonen während Stummschaltung eines Gens, das ciliated Zelle Organisation regelt flüssige Geschwindigkeit und Richtung stört.

Morpholinos eignen sich auch sehr schnell und zuverlässig modellieren menschliche Erbkrankheiten. Verlust der Funktion Phänotypen können leicht reproduziert werden durch Manipulation der Proteinexpression, wie in einem Zebrafisch-Modell der menschlichen Dysplasie Anzeige Nieren Zysten, Herzbeutel Ödem und eine geschwungene Rute zu sehen. Darüber hinaus können pathogene Mutationen schnell in vivo untersucht werden mithilfe von Wildtyp oder mutierte mRNA Morpholino Krankheit Phänotypen zu retten.

Da Morpholinos in lebende Zellen auf unterschiedliche Weise eingeführt werden können, sind sie hoch geschätzt, im Studium der Organregeneration und Entwicklung. Mikroinjektion gefolgt durch elektrische Stimulation der Morpholinos in bestimmten Geweben ermöglichte Forscher Fin Wachstum und Netzhaut Bildung im Erwachsenen Zebrafisch zu studieren.

Sie habe nur Jupiters Einführung in Gen-silencing mit Morpholinos beobachtet. In diesem Video haben wir die Struktur und Mechanismus der Morpholinos, gängige Anwendungen für die Verwendung und wichtige Möglichkeiten, um die Wirksamkeit zu beurteilen und Wirkungen der gezielte Gen-silencing diskutiert. Weil sie einfach zu gestalten sind, bleibt sehr spezifisch und kostengünstige, Morpholinos ein bedeutender Akteur auf dem Gebiet der reversen Genetik helfen, um Gene, die in Krankheit und Entwicklung funktionell zu analysieren. Danke fürs Zuschauen!

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