Morpholinos によるジーンサイレンシング

Developmental Biology

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Summary

Morpholino 媒介性遺伝子サイレンシングは開発中に特定の遺伝子の役割を研究するために使用する一般的な手法です。Morpholinos は、相補的な Mrna を交配させることによって遺伝子発現を抑制します。彼らのユニークな化学のため morpholinos が簡単に作成し、それらになります非常にコスト効果的な他のジーンサイレンシングのメソッドと比較して、保存します。

このビデオは、ときにこれらのオリゴヌクレオチドを使用して適切な実験的なデザインをレビューします。ゼブラフィッシュにおける morpholino マイクロインジェクション技術の説明と結果として得られる表現型の分析、説明を次します。最後に、発達障害をモデルに組織再生の研究に morpholino 技術が使用されている特定のアプリケーションの例を紹介します。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 発生生物学の必需品. Morpholinos によるジーンサイレンシング. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

遺伝子サイレンシングのテクニックは、発生生物学の分野でよく使用されます。Morpholino ノックダウン手法は定期的に両方の識別し、重要な細胞プロセスにかかわる遺伝子を分類する研究者を許可します。アンチセンス morpholinos マウス、雛、高効率、高い特異性、低コストなど、ゼブラフィッシュなど多くのモデル システムで広く普及している今。

このビデオは morpholino メカニズム ・ マイクロインジェクション戦略、主要な実験的コントロール、morpholinos を脊椎動物の開発を調査する今日のラボで使用されている方法の概要を提供します。

Morpholinos は、生きている細胞や生物の RNA 転写物の翻訳を抑制する方法として最初に開発されました。一般に、morpholinos は中立的荷電のバックボーンによって接続されている 25 のオリゴヌクレオチドの合成分子です。

しかし、糖リン酸塩のバックボーンは、砂糖のグループの代わりにモルホリン リングが含まれている morpholinos は、DNA のようにたくさん見えるかもしれませんが。この単純な変換細胞で morpholino 安定性を増加し、生産のコストは下がります。

細胞内 morpholinos は相補的な基本を組み合わせることで目的の RNA を対象と。Morpholino が交配 RNA 上の場所は、その特定作用メカニズムを決定します。

スプライス ブロック morpholinos 固有接合にバインドし、適切なトラン スクリプト処理、翻訳ブロック morpholinos 並進開始サイトの近くの遺伝子の 5' 非翻訳領域内のバインドし、リボソームの組み立てを防ぐに対し阻害します。Morpholinos の両方のタイプは、機能のターゲット蛋白質の表現を減らします。

Morpholinos を用いた実験を計画するときに留意すべきいくつかの重要な考慮事項があります。手での生物学的問題に対処することができるモデルを選択する上で重要ないくつかのモデル系 Morpholinos を使用できます。

Morpholinos が合成される商業的、専門的な設計支援は、研究者に無償で利用可能なすべて特定 morpholino ターゲットの遺伝子情報がデザインする前に食材をする必要があります彼らはシーケンスに固有なので。

ゼブラフィッシュ モデル システムでしばしば、ゼブラフィッシュの発展の祖先で発生した全ゲノム重複イベントのため、他の脊椎動物で見つけられた単一の遺伝子の 2 つのコピーがあります。したがって、両方のゼブラフィッシュ遺伝子のノックダウン正常にモデル蛋白質不足人間開発に必要があります。

良い実験的コントロールを設計対象の morpholinos の設計と同じくらい重要です。任意の与えられた morpholino は異なる遺伝子の特定のシーケンスにバインドできます。確実に興味の遺伝子のノックダウンによる観測の形質転換するために独立した、非重複の morpholinos の同じ遺伝子を補完するものを使用することをお勧めします。

Morpholino 実験的なデザインを対処した私たちは、今、ゼブラフィッシュに morpholinos を導入する方法を見てがあてしましょう。

ここでは、ゼブラフィッシュに morpholino マイクロインジェクションについて述べる。マイクロインジェクションの詳細上の命令の洞察力は、ください参照ゼウス科学教育ビデオ権利「ゼブラフィッシュ マイクロインジェクション技術」

Morpholinos は、ゼブラフィッシュ胚卵黄に、1 と 4 セル段階の間に注入される通常または細胞質を細胞します。萌芽期細胞の間の細胞質接続できます急速な普及と水溶性 morpholinos 生物全体のユビキタス配信。28.5 ° c. にゼブラフィッシュ胚が発生するので、Morpholinos は細胞で安定しています。

最適注入濃度とボリュームは、各 morpholino の経験的テストする必要があります。通常、胚性致死または不要なオフターゲット効果を避けるために低用量で注入された胚の少なくとも 50-75% に定義された信頼性の高い表現型があるが使用されます。

最初の 3 日後受精ほとんど morpholino ゼブラフィッシュの表現型と遺伝子サイレンシング、5 日目から一般的に効果的。スプライス ブロック morpholinos 場合 RT-PCR はネイティブと変更された転写産物の相対量を識別するために使用できます。翻訳ブロック morpholinos 遺伝子の打撃のレベルは西部のしみの評価があります。

迅速な外部開発とゼブラフィッシュ胚の透明性多くの初期の生物学的プロセスの簡単な観察が可能です。Morpholino の表現型は、明視野観察や蛍光顕微鏡を用いた形態を分析することによってだけでなく、挙動を評価することによって一般的が得点します。

Morpholino の表現型を定義すると、ターゲットの特異性を示す RNA 救助が可能です。内在性 mRNA の morpholino 打撃、次は、同じタンパク質をエンコードが morpholino ターゲット シーケンスが含まれていない、合成 mRNA が注入されます。この注入された RNA は生物の野生型表現型を復元することができる、我々 は、観察される morpholino 表現型はターゲット遺伝子により具体的にノックダウンを判断できます。

感触があるため morpholinos、morpholino のどの制御実験を行うことが、生体研究所で morpholinos が適用されて今日を見てみましょう。

細胞生物学、morpholinos を使用して初期発達過程を理解します。クッパーの小胞内の流体の流れの繊毛によって生成されたは、ゼブラフィッシュの左右パターン形成を制御する 1 つの例です。流体の流れは、流体の速度と方向を混乱させる繊毛細胞組織を調節する遺伝子のサイレンシングに対し制御注入胚で、反時計回りに実行されます。

Morpholinos は、迅速かつ確実に人間の遺伝病をモデルに非常に適しています。機能喪失の表現型は、腎嚢胞、心膜の浮腫と丸まった尾を表示する人間の異形成のゼブラフィッシュ モデルに見られるように簡単にタンパク質発現を操作することにより再現できます。また、病原性変異することができます急速に試金する体内 morpholino 疾患表現型を救出する野生型と変異体の mRNA を用いた。

Morpholinos は、さまざまな方法で生活細胞に導入することができます、ので器官再生及び開発的に評価されます。特定の臓器に morpholinos の電気刺激が続いてマイクロインジェクション フィンの成長と大人のゼブラフィッシュの網膜形成の研究に研究ができました。

ゼウスの遺伝子サイレンシング morpholinos で入門を見てきただけ。このビデオでは、構造と morpholinos、使用、および有効性を評価する重要な方法の一般的な用途のメカニズムおよび目標とされた遺伝子サイレンシングの効果を説明しました。彼らは設計は簡単なので、非常に特定でコスト効果の高い、morpholinos は機能的疾患と開発に関与する遺伝子を分析する手助け逆遺伝学の分野における重要なプレーヤーになります。見てくれてありがとう!

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