Overview
Transgenese oder der Einsatz von Gentechnik, Genexpression, zu ändern ist auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie verbreitet. Wissenschaftler verwenden eine Reihe von Ansätzen, um die Funktion von Genen zu verstehen, ihre Rollen in den Entwicklungsprozessen zu ändern. Dies beinhaltet den Austausch eines Gens mit eine nicht funktionsfähige Kopie, oder indem ein visualizable Tag, ein Gen, das die daraus resultierenden Schmelzverfahren Protein während der gesamten Entwicklung verfolgt werden kann.
In diesem Video erfahren die Zuschauer über die Prinzipien, die hinter Transgenese, sowie die grundlegenden Schritte für die Einführung von genetischen Konstrukte in ein Tier und gezielt Gene von Interesse. Darauf folgt die Diskussion eines Protokolls zum Knockout-Mäusen zu erstellen. Schließlich werden einige spezifischen Anwendungen transgene Technologien auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie überprüft werden.
Procedure
Gentechnik ist ein wertvolles Werkzeug zum Ändern der Genome von Modellorganismen in einem Prozeß bekannt als Transgenese verwendet. In der Entwicklungsbiologie ist dieser Ansatz oft zur veränderte Genen auszudrücken, die in lebenden Geweben visualisiert werden können. Alternativ kann Gentechnik verwendet werden, zu verhindern oder stören Proteinexpression um die entwicklungspolitische Funktion bestimmter Gene zu untersuchen.
Dieses Video wird die Prinzipien, die hinter dieser Technologie zusammenfassen, überprüfen einige gentechnische Verfahren und Highlight-Möglichkeiten, wie diese Techniken im Labor verwendet werden.
Um zu beginnen, schauen wir uns einige wichtige Konzepte zugrunde liegenden Transgenese. Dies beinhaltet einführen von DNA in das Genom des Modellorganismus. Es gibt eine Reihe von Ansätzen, die je nach Ziel der Studie.
Erstens könnte die Zugabe eines veränderten Gens funktionelle oder morphologische Veränderungen aufgrund einer Mutation offenbaren. Eine andere Methode ist, zusätzliche Kopien des unveränderten Wildtyp Gens zur Studie über die Auswirkungen der Überexpression, die oft ebenso schädlich wie eine Mutation kann. Ein anderer Ansatz ist, ein Fusionsprotein einzufügen, die enthält einen visualizable Tag, wie z. B. grün fluoreszierendes Protein, um Ort und Zeit der Genexpression mit lebenden Tieren zu verfolgen.
Das Segment von DNA, die in das Genom eingefügt werden muss sorgfältig geplant werden, um die gewünschte Expressionsmuster und Ergebnisse zu produzieren. Der Projektträger, der einen Sequence-Element, die bestimmt, wann und wo ein Gen exprimiert wird, ist eine entscheidende Komponente. Einiger Träger werden ubiquitär in fast allen Geweben exprimiert, während andere nur in bestimmten Geweben aktiv sind. Induzierbare Promotoren, die durch chemische Verwaltung oder Exposition gegenüber hohen Temperaturen aktiviert werden, können auch verwendet werden, zum Zeitpunkt der Genexpression steuern.
Um stabil in Geweben ausgedrückt werden, muss zuerst ein Transgen in das Genom integrieren. Um dies zu erreichen, können transgene gehören flankierende DNA-Sequenzen, die Bereiche des Genoms des Organismus anzupassen. Dies ermöglicht das Transgen, mit dem Host DNA durch einen Prozeß bekannt als homologe Rekombination zu integrieren. Alternativ können bei einigen Arten Sonderelemente Transposons genannt Transgenese effizienter gestalten von einschließlich Anerkennung Sites für das Enzym Transposase, das zufällige einführen des Transgens in das Genom katalysiert.
Nun, da Sie wissen, dass einige der Grundlagen des Transgens Designs, betrachten wir wie ein transgenen Tieres zu machen. Um das Transgen konstruieren, starten Sie durch das gen des Interesses mittels PCR Verstärkung. Diese verstärkte Region wird dann in einen Vektor geklont ist ein Stück DNA, die das Transgen in Zellen tragen kann. Vektoren in der Regel enthalten Elemente, die effiziente Transgen Amplifikation mit Bakterien wie E. Coli. Nach diesem Schritt Verstärkung wird der Vektor aus der Bakterienkultur gereinigt.
Transgene Tiere werden durch Einspritzen von gereinigte DNA in Embryonen hergestellt. In Fische und Frösche sind Konstrukte in der Regel direkt in das Eigelb oder Zytoplasma der einzelligen Embryonen injiziert. Für Transposon-vermittelten Transgenese ist eine Abschrift des Enzyms Transposase Kodieren der Injektion Mischung hinzugefügt.
Bei Mäusen kann Transgenese durch Manipulation der neu befruchtete Eizellen erfolgen, in denen die Ei- und Samenzelle Vorkerne noch nicht verschmolzen haben. Das Konstrukt wird direkt in der größeren Pronukleus injiziert, wo es in das Genom integrieren kann, wie die Zelle teilt. Die Eizellen müssen dann in die Gebärmutter einer pseudopregnant Frau für Entwicklung verpflanzt werden.
Transgenese Effizienz variiert, so dass die Tiere untersucht werden müssen, um Nachkommen zu identifizieren, in denen das Konstrukt erfolgreich ins Genom integriert hat. Dies kann durch die Suche nach einem fluoreszierenden Tag, der zur einfachen Identifizierung oder durch molekulare Analysen wie PCR genomischer DNA isoliert von kleinen Gewebe Stücke eingefügt wurde.
Ein zweiter Ansatz zur Gentechnik konzentriert sich auf spezifische Gene targeting um Genfunktion zu stören. Es gibt mehrere Ansätze, dieses Ziel zu erreichen. Eine relativ neue Methode, bekannt als Genom-Bearbeitung, nutzt die Sequenz-spezifische Enzyme genannt Nukleasen, die Schneiden des DNA-Rückgrat und Mutationen in Genen verursachen, wie die DNA repariert wird.
Ein weiterer Ausrichtungsmethode beinhaltet die Nutzung der homologen Rekombination, ein Gen mit entweder Fremd-DNA zu ersetzen oder eine Kopie des Gens flankiert von Erkennungssequenzen für Enzyme, die als Rekombinasen bekannt. Wenn der Rekombinasen vorhanden sind, wird die flankiert Sequenz aus dem Genom herausgeschnitten. Dies ist bekannt als eine bedingte Ko und Steuerung von gen Exzision kann erreicht werden durch das Enzym in bestimmten Geweben oder zu bestimmten Zeitpunkten zum Ausdruck zu bringen.
Betrachten wir ein allgemeines Verfahren zur Erzeugung von Knockout-Mäusen durch homologe Rekombination. Hier muss ein Konstrukt bereit sein, in welchem Teil der genomischen DNA Sequenz mit Fremd-DNA ersetzt wird. Diese DNA kodiert oft ein weiteres gen, wie z. B. für Antibiotika-Resistenz, die bietet eine Möglichkeit, erfolgreich wählen Zellen in späteren Schritten geändert.
Um den Vorgang zu starten, sind embryonaler Stammzellen aus der inneren Zellmasse eines frühen Maus-Embryos bekannt als Blastozyste gesammelt. Die linearisierte Konstrukt wird dann in die Stammzellen über Elektroporation, geliefert in denen elektrische Impulse transiente Poren in der Zellmembran erzeugen. Die Zellen sind dann erlaubt, brüten Sie in Anwesenheit eines Antibiotikums, Zellen ohne das Transgen zu beseitigen.
Nach diesem Auswahlschritt können die Stammzellen in eine andere Maus-Embryo im Blastozystenstadium injiziert werden. Die Embryonen werden dann in die Gebärmutter einer weiblichen Maus weiterhin Entwicklung übertragen. Die daraus resultierenden Welpen werden Chimären, die aus Wildtyp und Knockout-Zellen zusammengesetzt sind. Einige Chimären haben Ko-Zellen in der Keimbahn, die das gestörte gen übertragen wird, wenn sie gezüchtet werden, die dann eine neue Ko-Linie etablieren wird.
Sie haben gelernt, die Grundlagen der Gentechnik der Entwicklungs-Modelle, so, jetzt lassen Sie uns einige praktischen Anwendungen betrachten.
Studien verwenden oft Eindringmittel tagged Proteine, um Zellen zu identifizieren und ihre Entwicklung zu studieren. Mit gewebespezifische Promotoren, transgene Organismen zu express fluoreszierende Proteine in bestimmten Zellen, wie der Neuralleiste projektierbar. Mit modernen bildgebenden Verfahren, können die fluoreszierenden Zellen in Echtzeit, so dass Forscher direkt visualisieren komplexer Entwicklungsstörungen Ereignisse dargestellt werden.
Eine andere wichtige Anwendung der Gentechnik ist es, bestimmte Gene und ihre Rolle in der Krankheit Phänotypen zu studieren. Hier werden gezielte Mutationen in einem bestimmten Maus gen mit Nukleasen wie TALENs vorgestellt. PCR zeigt an, ob die Maus verfügt über Null, eins oder zwei Kopien des mutierten Gens. Die Embryonen tragen zwei mutierte Kopien können jetzt im Detail zu bestimmen, die entwicklungspolitische Funktion des Gens untersucht werden.
Mit bedingten Knockouts, können Wissenschaftler die Funktion eines Gens in einer eingeschränkten Gruppe von Zellen bestimmen. Hier ein Gen LoxP flankiert war während des gesamten Embryos exprimiert, aber Cre drückte sich in Endothelzellen, verursacht eine gen-Löschung in das Herz und die Blutgefäße. Diese gewebespezifischen Ko führte zu eine messbare Änderung der embryonalen Herzfrequenz und veranschaulicht, wie die lokalisierte Rolle eines Gens zu testen, ohne den gesamten Organismus.
Sie habe nur Jupiters Einführung in transgenen Technologie beobachtet. Diese Techniken helfen, Sie verstehen die Grundlagen der Gentechnik, einige der Methoden, die beteiligt sind, und wie ist es in der täglichen Wissenschaft angewandt. Gentechnik kann weit über viele Organismen angewendet werden und wird auch weiterhin ein wichtiges Hilfsmittel für das Studium und Verständnis der Rolle der Genetik in der Entwicklungsbiologie Erkrankungen, sowie diejenigen, die im Erwachsenenalter zu erscheinen. Danke fürs Zuschauen!
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