Cultura de explante para estudios del desarrollo

Developmental Biology

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Summary

Cultura de explante es una técnica en la cual las células vivas o tejidos se quitan de un embrión de desarrollo fuera del organismo. Este enfoque ex vivo permite a los investigadores manipular y observar los tejidos en desarrollo en formas que no son posibles en vivo. Una vez establecida, cultura del explante se usa frecuentemente para entender el papel de los genes y moléculas de señalización en la organogénesis.

Este video primero introducir los principios básicos de la cultura de explante y demostrar un protocolo para aislar y hacer crecer los tejidos mamíferos explanted. Luego se discutirán métodos genéticos y moleculares comunes de manipular culturas explant. Por último, los espectadores conocerán como explante técnicas se están aplicando actualmente para estudiar el desarrollo del órgano.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la biología del desarrollo. Cultura de explante para estudios del desarrollo. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Cultura de explante es una técnica en que se extirpan órganos y tejidos todo o "explantados," de un feto o embrión y se cultivan por el cuerpo o "ex vivo". Estos métodos proporcionan una ventana única para ayudarnos a entender el proceso de desarrollo permitiendo observaciones directas de órgano y tejido crecimiento, un proceso denominado organogénesis.

Este video examinar los principios básicos de la cultura del explante, señalar las etapas claves del procedimiento, discutir las manipulaciones típicas y específicas aplicaciones de esta técnica en estudios del desarrollo.

Antes de describir cómo cultivar explantes, vamos a repasar algunos de los principios detrás de esta técnica.

Explante es aplicable a una variedad de tejidos embrionarios de una amplia gama de organismos. Esta técnica es ideal para el estudio del desarrollo del órgano, como los cambios estructurales, conocido como morfogénesis, puede observarse directamente como una función del tiempo. Además, los tejidos pueden tratarse con moléculas experimentales para determinar su impacto en el desarrollo. Por otra parte, cuando cultura de explante se combina con herramientas moleculares para alterar la gene expresión y fluorescencia microscopía, se convierte en una herramienta poderosa para abordar cuestiones de diferenciación de células y tejidos.

A continuación, vamos a revisar un protocolo para el cultivo de explantes de tejidos mamíferos.

Para iniciar el procedimiento, se eliminan embriones de roedores embarazada eutanasia. Después de la eliminación de las membranas circundantes, el embrión está aislado. Los tejidos u órganos de interés entonces aislados el embrión extraído y transferidos a las placas de crecimiento. Se agregan los medios de comunicación que contengan antibióticos y las placas se cultivan en una incubadora de 37° C. Explantes de tejido están listos para su manipulación.

Una vez que se establecen las culturas explant, pueden realizarse varios tipos de manipulaciones.

Por ejemplo, el tejido explanted puede ser manipulado genéticamente para probar el papel de un gen de interés en un proceso de desarrollo específico. Esto puede lograrse mediante la introducción de material genético en el tejido usando técnicas como la electroporación, en la que un campo eléctrico se utiliza para conducir DNA inyectado en las células cercanas.

Explantes se utilizan también con frecuencia para probar las funciones que desempeñan las moléculas de señalización, como factores de crecimiento, en la organogénesis. Tejido cultivado en vitro es especialmente útil para este tipo de estudios porque el tratamiento con el compuesto es tan simple como añadir a los medios de cultivo. Sin embargo, pequeñas perlitas en compuestos experimentales pueden también implantarse en el tejido de un enfoque más controlado para tratamiento químico.

Sin importar el enfoque, una gran ventaja de la técnica de explante es que los efectos de manipulaciones experimentales pueden ser fácilmente visualizados en tiempo real, usando microscopia fluorescente o luz.

Ahora, echemos un vistazo a algunas aplicaciones específicas de la cultura ex vivo .

En primer lugar, explantes representan un modelo de sistema en el que tejido puede visualizarse directamente el desarrollo. Por ejemplo, estos investigadores había removido el páncreas en desarrollo de ratones embrionarios y cultivan en los platos de fondo de cristal para mejorar la proyección de imagen.

Desarrollo del tejido puede ser observado por microscopía de luz, pero la utilización de tejidos transgénicos expresando marcadores fluorescentes proporciona una vista más detallada de procesos de desarrollo, como el florecimiento del túbulo. Tejido explanted puede someterse también a immunostaining, que permite a los investigadores el desarrollo de tipos específicos de la célula, como las células productoras de insulina en azul y verde.

Otra aplicación de culturas explant es ayudar a descifrar el papel de determinadas moléculas, como factores de crecimiento, en la organogénesis.

Aquí, explantes pulmonar fetal disecados de embriones de ratón E12.5 fueron cultivados en la presencia o ausencia de un factor de crecimiento de hasta 48 horas. Los resultados indican que este factor de crecimiento inhibe la formación de las vías respiratorias en el pulmón fetal.

Por último, los explantes de embriones tempranos pueden utilizarse para determinar los mecanismos que controlan la expresión génica durante las primeras etapas de la embriogénesis.

Estos investigadores explantados dos diferentes tipos de células de la fase de 16 células de embriones de rana: los que están destinados a formar las estructuras dorsales y los que contribuyen a las estructuras ventrales. Los explantes se permitieron desarrollar para un día antes de la tinción para caracterizar el patrón de expresión de un gen específico de tejido dorsal.

Puesto que la expresión de este gen sólo se observó en explantes de la región dorsal, se concluyó que los programas de expresión génica se codificaron en estas células embrionarias, en lugar de ser dirigido por interacciones célula-célula que ocurren más adelante en el desarrollo.

Ahora hemos visto los sistemas de cultivo de explantes y observa cómo puede utilizarse en estudios del desarrollo. Esta técnica es una poderosa herramienta que facilita nuestra comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes de desarrollo animal. ¡Gracias por ver!

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