Diferenciación y cultivo de células madre embrionarias

Developmental Biology

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Summary

Cultivo de células madre embrionarias (ES) requiere condiciones que mantienen estas células en un estado indiferenciado para preservar su capacidad de auto renovación y pluripotencia. Biólogos de la célula de vástago continuamente están optimizando métodos para mejorar la eficiencia del cultivo de células ES y al mismo tiempo están tratando de dirigir la diferenciación de células madre embrionarias en tipos celulares específicos que podrían utilizarse en medicina regenerativa.

Este video describe los principios básicos de la cultura de célula ES y demuestra un protocolo general para crecer y paso de células madre embrionarias. También tomamos una mirada más cercana en el colgante gota método, que se utiliza para diferenciar células madre embrionarias. Por último, este video describe algunos usos de la cultura de célula ES y técnicas de diferenciación, incluyendo un método utilizado para generar funcional del corazón músculo células en vitro.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la biología del desarrollo. Diferenciación y cultivo de células madre embrionarias. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Las células madre embrionarias o células madre embrionarias, tienen un número de propiedades únicas que las distinguen de las células adultas normales. Por lo tanto, los científicos han ideado técnicas especiales de cultivo para mantener o tomar ventaja de estas propiedades. Cuando se cultivan adecuadamente, células madre embrionarias pueden dividir indefinidamente para hacer más de sí mismos. Al mismo tiempo, mediante la alteración de las condiciones de cultivo, células madre embrionarias pueden ser dirigidas a diferenciarse en casi cualquier tipo de célula en nuestro cuerpo; Esta capacidad de las células ES se llama "pluripotencia".

En este video vas a aprender de la cultura y paso a células madre embrionarias por lo que mantienen sus propiedades únicas, como inducir la diferenciación en ES células a tipos específicos de la célula de forma y las maneras en que ES técnicas de cultivo y diferenciación de la célula están siendo usada y refinada por los investigadores de hoy.

Antes de entrar en detalles de los procedimientos para el mantenimiento celular, es importante entender primero lo que previene o unidades de diferenciación de las células ES. A fin de células madre embrionarias conservar sus características únicas de la pluripotencia y auto-renovación, deben ser cultivadas con factores específicos en su medio de crecimiento que inhiben la diferenciación espontánea.

Esto es más comúnmente hecho por cultivo de células madre embrionarias en una capa de "alimentadores", ratón generalmente fibroblastos embrionarios o MEFs. Células de alimentador "alimentan" las células madre embrionarias ciertos factores, como la activina A, que ayudan a mantener las células madre embrionarias en estado indiferenciado.

Recientemente, los científicos también han desarrollado métodos de cultivo libre de alimentador en que ES las células se cultivan en medios de comunicación con los factores necesarios en una receta definida. Este enfoque reduce la variabilidad y elimina los componentes no humanos de cultivos de células ES, que es un requisito previo para aplicaciones clínicas.

Otra característica de células madre embrionarias es que naturalmente crecen en racimos o colonias y tienden a tener baja tasa de supervivencia cuando disociado en las células, especialmente células madre embrionarias humanas. Como resultado, pases de células madre embrionarias humanas generalmente requiere retención en grupos intactos a través de la mecánica "picking".

Cuando se cultivan células madre embrionarias en condiciones no adherente, se forman agregados 3D conocidos como cuerpos de embryoid, EBs, en el que las células madre embrionarias se diferencian en todos diferentes tipos de células. Variando las condiciones de diferenciación, tales como la adición de factores específicos de crecimiento al medio, los científicos están desarrollando métodos para dirigir la diferenciación celular ES hacia tipos celulares específicos.

Ahora que usted entiende que los principios ES mantenimiento y diferenciación de la célula, echemos un vistazo a cómo la cultura y paso de células madre embrionarias en alimentadores MEF.

MEFs se obtienen de embriones de ratón de etapa temprana y luego se inactivan por productos químicos o radiación para impedir que más división. MEFs inactivadas deben ser plateados en platos de cultivo de tejido gelatinizado por lo menos un día antes de empezar a cultivar células madre embrionarias. Cuando completamente son alimentadores, células madre embrionarias son descongelados y sembradas en las placas.

En los próximos días, células madre embrionarias se crecen en grandes colonias. Antes de que las colonias comienzan a tocar y el fusible, la cultura ES debe ser pasada. Se debe observar la morfología de las células ES para ver si muestran signos de diferenciación. Indiferenciado de las colonias ES mirada generalmente bien definido y homogéneo, mientras que las células diferenciadas se vería "adoquines" opacos, forma irregular.

Si las colonias tienen 70% o más de la diferenciación, o si son escasas, mecánicamente cortar las colonias indiferenciadas y transferirlos a un nuevo plato alimentador. De lo contrario, simplemente quite las áreas diferenciadas o colonias y proceda con pases.

Una vez que las colonias diferenciadas se han limpiado para arriba, las enzimas proteolíticas como la colagenasa, se agregan para levantar las células de la placa con incubación a 37° C para la cantidad de tiempo apropiada. Medios ES fresco entonces se agrega para detener las reacciones enzimáticas. Las colonias son mecánicamente desalojadas de la placa y transferidas a un tubo de centrífuga, donde se dividen en tamaños deseados con pipeteo suave. Las células madre embrionarias son recogidos por centrifugación, suspendidas en medios de comunicación ES y plateados sobre las placas preparadas alimentador.

Después de aprender a paso células madre embrionarias, echemos un vistazo a una de las técnicas más comunes utilizadas para diferenciar células madre embrionarias en embryoid colgar los cuerpos, el método de la gota.

Para empezar, células madre embrionarias son separados con la ayuda de enzimas proteolíticas como la colagenasa y diluidos a la concentración deseada en medios que contienen factores de diferenciación linaje-específicas. La suspensión de células ES es luego depositada en gotas en la tapa de una caja Petri bacteriana. La tapa invertida y rápidamente colocada en el plato, por lo que las gotas de los medios de comunicación se cuelgan boca abajo y deje que los cuerpos embryoid desarrollar.

Después de dos días, las gotas con EBs pueden ser recogidas y plateadas en las placas no adherente para el cultivo de más. En el punto de tiempo apropiado para el linaje de la célula deseada, cuerpos embryoid se platean en platos de cultura de tejido adherente gelatinizado para otra diferenciación.

Ahora que hemos cubierto las técnicas básicas de cultivo y diferenciación de células madre embrionarias, vamos a ver cómo se adaptan a necesidades experimentales.

Como se mencionó anteriormente, células madre embrionarias pueden ser dirigidas a diferenciarse en tipos celulares específicos bajo diferentes condiciones de cultivo. En este experimento, los científicos produjeron motor neuronas de células madre embrionarias humanas. Esto se hizo por primera agregando factores para diferenciar cuerpos embryoid que dirigen hacia el linaje neural, seguido por productos químicos y condiciones de la galjanoplastia que convierten estas células específicamente en las neuronas motoras. Utilizan enfoques similares, los investigadores han tenido éxito en la diferenciación de células madre embrionarias en batir rítmicamente las células musculares cardíacas.

Porque diferenciar células madre embrionarias imitan sucesos que ocurren como embriones desarrollan naturalmente, también lo podemos utilizar para investigar la biología del desarrollo embrionario temprano. Uno de los fenómenos en estudio es la inactivación del X-cromosoma, o XCI, el proceso crucial por el que uno de los dos X-cromosomas está silenciado en cada célula de un mamífero hembra. Visualizando la distribución de específico RNAs y proteínas en el desarrollo de EBs, los científicos obtuvieron valiosa información sobre la biología del XCI.

Por último, para aumentar la consistencia y la eficiencia de la experimentación de células ES, los científicos están continuamente intentando idear mejores técnicas para cultivo de células madre embrionarias. Un método consiste en cultivar células madre embrionarias en una sola capa, llamado tipo de Colonia no cultivo monocapa o NCM.

¿Recuerde que las células madre embrionarias humanas tienden a ser infeliz cuando no están creciendo como agregados 3D? Los científicos han demostrado que productos químicos conocidos como inhibidores de la roca aumentan la supervivencia de las células ES disociadas, que les permiten ser pasados como suspensiones celulares solo y ser plateado en alta densidad. La ventaja de la técnica NCM es que cada célula será más igualmente expuesto a factores de crecimiento y nutrientes en el medio, reducción de la heterogeneidad dentro de la cultura al tiempo que fáciles de cultivar células madre embrionarias en grandes cantidades.

Sólo has visto video de Zeus sobre cómo la cultura y diferenciar las células madre embrionarias. Ahora usted debe saber qué factores son importantes para el mantenimiento de células madre embrionarias en su estado indiferenciado, y cómo podemos aprovechar de ES celular pluripotencia para generar tipos específicos de la célula en un plato. A futuro, los científicos trabajando para desarrollar más eficientes y bien definidas el cultivo y diferenciación condiciones para producir tipos de células especializadas que pueden utilizarse en aplicaciones de la medicina regenerativa. ¡Gracias por ver!

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