Embryonale Stammzelle-Kultur und Differenzierung

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Advanced Biology collection to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Kultivierung embryonale Stammzellen (ES) erfordert Bedingungen, die diese Zellen in einem undifferenzierten Zustand, ihre Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Pluripotenz zu bewahren pflegen. Stem Cell Biologen Methoden zur Verbesserung der Effizienz der Zellkultur ES kontinuierlich optimieren und gleichzeitig versuchen, die Differenzierung von ES-Zellen in bestimmten Zelltypen zu lenken, die in der regenerativen Medizin verwendet werden könnte.

Dieses Video beschreibt die grundlegenden Prinzipien der ES Zellkultur und zeigt ein allgemeines Protokoll, um wachsen und passage embryonaler Stammzellen. Wir nehmen auch einen genaueren Blick auf die hängenden Tropfen-Methode, die verwendet wird, um ES-Zellen zu differenzieren. Schließlich wird dieses Video ein paar Anwendungen ES Zellkultur beschreiben und Differenzierung Techniken, einschließlich eine Methode zur Erzeugung von funktionellen Herz-Muskel Zellen in Vitro.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Grundlagen der Entwicklung Biologie. Embryonale Stammzelle-Kultur und Differenzierung. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Embryonale Stammzellen oder ES-Zellen haben eine Reihe von einzigartigen Eigenschaften, die sie von normalen adulten Zellen zu unterscheiden. Daher haben Wissenschaftler Kultivierung Spezialtechniken zur Aufrechterhaltung oder nutzen die Vorteile dieser Eigenschaften entwickelt. Wenn richtig kultiviert, können ES-Zellen auf unbestimmte Zeit teilen, um mehr aus sich zu machen. Zur gleichen Zeit können durch Veränderung der Kultivierung Bedingungen Embryonische Stammzellen gerichtet werden, in fast jedem Zelltyp fanden in unserem Körper zu unterscheiden; Diese Fähigkeit von ES-Zellen nennt man "Pluripotenz."

In diesem Video wirst du lernen, wie man Kultur und passage embryonaler Stammzellen, so dass sie ihre einzigartigen Eigenschaften pflegen, wie induzieren Differenzierung in ES in bestimmten Zelltypen Form Zellen und die Art und Weise, in denen ES-Kultivierung und Differenzierung Techniken Handy, werden verwendet und verfeinert von Forschern heute.

Bevor ich auf Einzelheiten der Verfahren für die ES Zelle Wartung, ist es wichtig, zuerst zu verstehen, was verhindert oder treibt ES-Zell-Differenzierung. In Reihenfolge für ES-Zellen, deren einzigartige Eigenschaften der Pluripotenz und Selbsterneuerung zu behalten müssen sie mit bestimmten Faktoren in ihrem Wachstumsmedium kultiviert werden, die spontane Differenzierung zu unterdrücken.

Dies ist den meisten allgemein durch die Kultivierung embryonaler Stammzellen auf einer Schicht von "Feeder" gemacht, in der Regel Maus embryonalen Fibroblasten oder MEFs. Feeder-Zellen füttern"" den ES-Zellen bestimmte Faktoren, wie Activin A, die helfen, um ES-Zellen in ihrer undifferenzierten Zustand zu erhalten.

Vor kurzem haben Wissenschaftler auch Feeder-freie Kultivierung Methoden entwickelt, in denen, die es Zellen in Medien mit den notwendigen Faktoren in einem definierten Rezept hinzugefügt angebaut werden. Dieser Ansatz reduziert die Variabilität und entfernt die nicht-menschliche Komponente aus ES Zellkulturen, eine Voraussetzung für klinische Anwendungen.

Ein weiteres Merkmal von ES-Zellen ist, dass sie natürlich in Clustern oder Kolonien wachsen, und neigen dazu, geringe Überlebensrate bei getrennt in einzelne Zellen, vor allem humanen ES-Zellen haben. Infolgedessen erfordert Passagierung humanen ES-Zellen in der Regel binden in intakten Klumpen durch mechanische "pflücken."

Wenn ES-Zellen in nicht-adhärenten Bedingungen angebaut werden, bilden sie 3D Aggregate Embryoid Körper oder EBs, in denen ES-Zellen in alle verschiedenen Zelltypen differenzieren werden genannt. Durch Variation der Differenzierung Bedingungen, wie die Zugabe von speziellen Wachstumsfaktoren auf das Medium entwickeln Wissenschaftler Methoden um ES-Zell-Differenzierung in bestimmten Zelltypen zu lenken.

Nun, Sie die Prinzipien hinter ES Wartung und Differenzierung Zelle verstehen, wie Kultur und passage embryonaler Stammzellen auf MEF Feeder betrachten.

MEFs stammen aus frühen Stadium Mausembryonen und werden dann durch Chemikalien oder Strahlung zu verhindern, dass weitere dividiert inaktiviert. Inaktivierten MEFs sollte auf verkleisterte Gewebekultur Gerichte mindestens einen Tag vor Beginn der Embryonischen Stammzellen Kultur überzogen. Wenn Anleger vollständig ausgeglichen sind, sind ES-Zellen aufgetaut und auf die Teller ausgesät.

In den nächsten Tagen werden ES-Zellen in großen Kolonien wachsen. Bevor die Kolonien beginnen zu berühren und zu verschmelzen, sollte ES Kultur passagiert. Man sollte beobachten, die ES-Zellen Morphologie zu sehen, ob sie für eine Differenzierung Anzeichen sind. Undifferenzierte ES Kolonien sehen in der Regel klar definierte und homogene, während differenzierte Zellen aussähe, stumpf, unregelmäßig geformten "Kopfsteinpflaster".

Wenn Kolonien 70 % oder mehr der Differenzierung zeigen, oder wenn sie spärlich sind, mechanisch die undifferenzierten Kolonien geschnitten Sie aus und übertragen Sie sie auf eine neue Feeder-Platte. Ansonsten einfach den differenzierten Bereichen oder Kolonien zu entfernen und mit Passagierung fortfahren.

Sobald die differenzierte Kolonien bereinigt wurden, werden proteolytische Enzyme wie Kollagenase, heben Sie die Zellen aus der Platte mit Inkubation bei 37 ° C für die entsprechende Menge an Zeit hinzugefügt. Frische ES Media wird dann hinzugefügt, um die enzymatischen Reaktionen zu stoppen. Die Kolonien sind mechanisch verdrängt von der Platte und in ein Zentrifugenröhrchen übertragen, wo werden sie in gewünschten Größen mit sanften Pipettieren aufgeteilt. Die ES-Zellen sind durch Zentrifugation gesammelt, Nukleinsäuretablette in ES-Media und auf die vorbereiteten Feeder-Platten beschichtet.

Nach dem lernen, wie man ES-Zellen die passage, betrachten wir eine der häufigeren Techniken verwendet, um ES-Zellen in Embryoid Körper-die hängenden differenzieren drop-Methode.

Um zu beginnen, sind ES-Zellen getrennt mit Hilfe von proteolytischen Enzymen wie Kollagenase und verdünnt, um die gewünschte Konzentration in Medien, die Geschlecht-spezifische Differenzierungsfaktoren. Die Zellsuspension ES lagert sich dann in Tropfen auf den Deckel einer bakteriellen Petrischale. Der Deckel ist schnell umgedreht und auf dem Teller platziert, so die Medien Tropfen kopfüber hängen und die Embryoid Körper ermöglichen entwickeln werden.

Nach etwa zwei Tagen können die Tropfen mit EBs gesammelt und auf nicht-anhaftende Teller für die weitere Kultivierung überzogen. Der geeignete Zeitpunkt für die gewünschte Zelle Linie sind Embryoid Körper wieder auf verkleisterte adhärente Zellkultur Gerichte zur weiteren Differenzierung beschichtet.

Nun, da wir die grundlegenden Techniken der Kultivierung und Differenzierung Embryonische Stammzellen behandelt haben, schauen Sie wie sie für experimentelle Bedürfnisse zugeschnitten sind.

Wie bereits erwähnt, können ES-Zellen gerichtet werden, in bestimmten Zelltypen unter verschiedenen Bedingungen Kultivierung zu unterscheiden. In diesem Experiment produziert Wissenschaftler Motoneuronen aus humanen ES-Zellen. Dies geschah durch ersten Hinzufügen von Faktoren zur Differenzierung Embryoid Körper, die direkt in Richtung der neuronalen Linie, gefolgt von Chemikalien und Beschichtung-Bedingungen, die diese Zellen gezielt zu motorischen Neuronen zu machen. Mit ähnlichen Ansätzen haben Forscher bei der Unterscheidung von ES-Zellen zu rhythmisch schlagenden Herzmuskelzellen erfolgreich.

Weil differenzierende Embryonische Stammzellen Veranstaltungen, die auftreten imitieren wenn Embryonen natürlich entwickeln, können wir auch verwenden, um die Biologie der frühen embryonalen Entwicklung zu untersuchen. Eines der untersuchten Phänomene ist X-Chromosom Inaktivierung oder XCI, der entscheidende Prozess, wobei eines der beiden Chromosome in jeder Zelle eines weiblichen Säugers zum Schweigen gebracht wird. Durch die Visualisierung der Verteilung des spezifischen RNAs und Proteine bei der Entwicklung von EBs, haben Wissenschaftler wertvolle Einblicke in die Biologie der XCI gewonnen.

Schließlich, um die Konsistenz und Effizienz der ES Zelle Experimente zu erhöhen, ständig versuchen Wissenschaftler, bessere Techniken zur Kultur, embryonaler Stammzellen zu entwickeln. Ein Ansatz ist ES-Zellen in einer einzigen Schicht, genannt-Kolonie Typ Monolage Kultivierung oder NCM wachsen.

Denken Sie daran, dass humanen ES-Zellen sind in der Regel unglücklich sein, wenn sie nicht als 3D Aggregate wachsen? Wissenschaftler haben gezeigt, dass Chemikalien bekannt als ROCK-Hemmer das Überleben der dissoziierten embryonaler Stammzellen zu erhöhen, damit sie als Einzel-Zellsuspensionen passagiert und in hoher Dichte beschichtet werden können. Der Vorteil der NCM-Technik ist, dass jede Zelle Wachstumsfaktoren und Nährstoffe in das Medium, Verringerung der Heterogenität innerhalb der Kultur während erleichtert ES-Zellen in großer Zahl wachsen gleichmäßiger ausgesetzt wird.

Sie haben genau beobachtete Jupiters Video zur Verwendung von Kultur und embryonalen Stammzellen zu unterscheiden. Sie sollten jetzt wissen, welche Faktoren sind wichtig für die Aufrechterhaltung der, dass ES-Zellen in ihrer undifferenzierten Zustand, und wie wir ES nutzen können Zelle Pluripotenz um bestimmte Zelltypen in einer Petrischale zu generieren. In Zukunft werden Wissenschaftler arbeiten, um Bedingungen zu entwickeln mehr effizient und klar definierte Kultivierung und Differenzierung, spezialisierte Zelltypen zu produzieren, die in der regenerativen Medizin Anwendungen verwendet werden können. Danke fürs Zuschauen!

A subscription to JoVE is required to view this article.
You will only be able to see the first 20 seconds.

RECOMMEND JoVE

Applications