Overview
Source : Laboratoire de Dr. Lydia Finney, Argonne National Laboratory
Fluorescence des rayons x est un induit, émis un rayonnement qui peut être utilisé pour générer l’information spectroscopique. Microscopie de fluorescence de rayons x est une technique d’imagerie non destructifs qui utilise l’émission de fluorescence induite des métaux d’identifier et de quantifier leur répartition spatiale.
Principles
Tout d’abord, les échantillons doivent être préparés qui sont minces, plate et sèche (sauf si un étage cryogénique spécial est disponible pour le microscope). Ensuite, un faisceau de rayons x monochromatique concentré est scannée raster dans l’ensemble de l’échantillon. Le faisceau de rayons x permet de surmonter l’énergie de liaison de certains des électrons aux atomes de métal coque intérieure, et quand les électrons coquille externe tombent dans les postes vacants, une deuxième radiographie est émise par l’échantillon. À chaque instant de ce raster-scan, un spectre d’émission de x-ray fluorescence sont recueilli par le détecteur.
Dans cette partie du spectre, la longueur d’onde et l’intensité de tous les rayons x émis par l’échantillon est enregistrée. Basé sur l’énergie caractéristique (en raison de l’espacement des orbitales de l’atome), de la fluorescence émise et de l’intensité relative caractéristique de Kα etβ K (par exemple, qui sont tous deux reconnus), le spectre d’émission permet de déterminer l’identité des métaux présents ainsi que la quantité.
Cette vidéo vous expliquera le processus de préparation d’un échantillon mince et sec des cellules adhérentes pour imagerie par fluorescence. Le processus d’analyse des échantillons sera expliqué brièvement, et décrit une image par exemple.
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Procedure
1. préparer les fenêtres de nitrure de silicium
- Utiliser des pinces inversées pour ramasser une fenêtre (nitrure de silicium windows seront brisera en cas de chute).
- Placer la fenêtre sur une lame de verre, côté plat vers le haut.
- Respecter les petits morceaux de Scotch sur les côtés de la fenêtre et utilisez-les pour respecter les fenêtres vers le bas de la boîte de Pétri.
- Stériliser les fenêtres de Pétri avec les rayons UV. Ceci peut être accompli avec le paramètre auto-crosslink sur une armoire UV-réticulation, suivie par l’irradiation UV supplémentaire sous la lampe UV dans la hotte à flux laminaire pendant environ 1 h.
2. les cellules sur les vitres de nitrure de silicium stérilisé de placage
- Tenir le plat avec elle inclinée à un angle de 45°.
- Ajouter des éléments multimédias en pipettant également, du côté du plat et soulager lentement l’angle d’inclinaison pour enrober la fenêtre avec les médias.
- Ajouter des cellules à la boîte de Petri, de la même manière et incuber.
- Observer les cellules occasionnellement à l’aide d’un microscope optique pour déterminer quand ils sont prêts à l’emploi.
3. la fixation et le séchage des cellules
- Dans une hotte à flux laminaire, retirez le support en aspirant doucement tout en inclinant le plat tel que décrit ci-dessus.
- Ajouter PBS, pipetage vers le côté du plat en le tenant à angle. Lentement, soulager l’angle d’inclinaison pour enrober la fenêtre avec du PBS.
- Supprimer les PBS avec aspirant doucement.
- Pipetage vers le côté du plat et en tenant à un angle, ajoutent 4 % PFA/PBS, pH 7 pour couvrir les cellules. Garder dans cette solution pendant 20 min à température ambiante.
- Retirer le mélange PFA/PBS et jeter comme des matières dangereuses.
- Ajouter PBS, pipetage comme décrit ci-dessus.
- Répétez les étapes 3.5 et 3.6 deux fois.
- Supprimer les PBS en aspirant doucement.
- Ajouter des tuyaux de 20 mM, saccharose de 200 mM, pH 7.
- Enlever le tuyaux/saccharose en aspirant doucement.
- Répétez les étapes 2.8 et 2.9 deux fois.
- Rapidement les bords de la tache et mise en retrait de la fenêtre avec un Kimwipe en arrière, puis définir la fenêtre sur une surface propre, comme un tapis de caoutchouc grille, sécher.
4. imagerie de Fluorescence des cellules de rayons x
- Une fois que l’échantillon est sec, vérifiez la présence de cellules sur les fenêtres à l’aide d’un microscope optique.
- Vernis à ongles permet de sécuriser les fenêtres à un titulaire en aluminium fournie par la source de rayonnement.
- Insérez le support d’aluminium dans une monture cinématique et puis placez-le en position au point focal de l’optique dans le microscope à rayons x et à un angle d’environ 45° du faisceau de rayons x, monté sur les étapes de nanopositionnement échantillon.
- Sortir de la zone d’instrument microscope à rayons x (habituellement une huche faite des murs de plomb) et ouvrir la trappe. Effectuer les étapes restantes à distance.
- À l’aide d’une plaque de zone ou miroirs Kirkpatrick-Baez, concentrer le faisceau de rayons x monochromatique (habituellement 10 keV d’énergie) jusqu'à une taille de tache sub-micronique.
- Utiliser les étapes d’échantillon de nanopositionnement et visualiser la position du faisceau de rayons x sur l’échantillon avec une caméra précalibré scintillateur en aval, déterminent la largeur appropriée et la hauteur du raster scan afin de capturer les données de l’échantillon.
- Avec le détecteur de dérive de silicium dispersive en longueur d’onde à 90° pour le faisceau incident et environ 3 mm ou moins de l’échantillon, recueillir un spectre pour l’essai avec un temps de pause de 1 à 2 sec.
- La visualisation du spectre pour l’essai, choisissez une durée appropriée pour l’analyse, pour fournir le signal sur bruit suffisant pour les éléments d’intérêt.
- Choisissez une résolution appropriée pour l’analyse, ce qui n’est pas significativement plus petite que la taille de tache du faisceau sur l’échantillon, ni plus grand que les caractéristiques d’intérêt dans l’échantillon.
- Programmer la numérisation dans le logiciel de numérisation et de recueillir l’image.
Fluorescence des rayons x, ou XRF, la spectroscopie est une technique analytique non destructrice qui est utilisée pour effectuer l’analyse élémentaire des échantillons à la température ambiante.
XRF peut être appliqué à un éventail d’échantillons, y compris biologiques, médecine légale, environnementaux et même oeuvres d’art. Les échantillons peuvent aussi prendre une variété de formes, telles que les poudres et cristaux liquides. En XRF, un échantillon est bombardé par un faisceau de rayons x faisant émettre des rayons secondaires x à une énergie plus faible, que l'on appelle rayonnement fluorescent.
S’il est fait référence comme une technique de fluorescence, XRF diffère de la microscopie en fluorescence traditionnels car il n’utilise pas de lumière visible de plus faible énergie ou des molécules de lumière active.
Cette vidéo va introduire les bases de la XRF et montrent comment collecter des cartes élémentaires d’un échantillon biologique.
Quand un photon d’énergie suffisante entre en collision avec un atome, l’énergie est absorbée, excitant l’un des électrons coquille externe. Lorsque l’électron se détendra, il émet un photon secondaire, généralement d’énergie plus faible. Ce processus est connu comme la fluorescence. Contrairement aux photons de faible énergie, comme ceux utilisés dans la microscopie de fluorescence, les photons des rayons x sont assez énergiques pour expulser complètement électrons étroitement tenues d’une coque intérieure. Un électron d’une coquille d’énergie plus élevée puis tombera dans le poste vacant. Un photon proportionnel à la différence d’énergie entre les deux coques est libéré. Chaque élément émet un ensemble unique de photons, ou spectre, qui peut être utilisé pour identifier l’élément et déterminer la quantité présente. Ce phénomène est connu comme la fluorescence des rayons x.
Une fois un spectre élémentaire a été recueilli, les signaux des éléments d’intérêt peuvent être isolés. Les mesures peuvent être prises sur plusieurs sites à travers un échantillon, générant une image, un pixel à la fois. Ce processus est appelé raster scanning. Images de tous les éléments d’intérêt peuvent être générés par la suite. Ces cartes élémentaires fournissent des informations précieuses sur l’échantillon. Avec une compréhension de XRF, vous êtes maintenant prêt à préparer un échantillon de cellules biologiques pour produire des cartes élémentaires.
Pour commencer, tout d’abord préparer et stériliser une fenêtre de nitrure de silicium, qui tiendra l’échantillon en place pour l’analyse. Soyez prudent, car ils sont très fragiles. Orienter la fenêtre afin qu’il soit côté plat vers le haut. Puis placer la fenêtre dans une boîte de Pétri, et il respecte le plat à l’aide de petits morceaux de ruban adhésif.
Enfin, stériliser la fenêtre de nitrure de silicium avec un rayonnement UV pour 1 heure.
Maintenant que la fenêtre a été stérilisée, l’échantillon peut être fixée à celle-ci. Tout d’abord, tenez la boîte de Petri à angle et ajouter des éléments multimédias sur le côté du plat. Lentement, soulager l’inclinaison pour enrober la fenêtre. Ajouter des cellules à la capsule de la même manière et incuber.
Régulièrement observer les cellules au microscope léger jusqu'à ce qu’ils sont prêts à l’emploi.
Dans une hotte à flux laminaire, aspirez doucement les médias du plat.
Ensuite, rincer les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate pour enlever l’excès médiatique.
Aspirer le PBS et fixer les cellules avec du paraformaldéhyde. Après 20 min, retirer le mélange et jeter parmi les déchets dangereux.
Supprimer la fenêtre de la capsule et rapidement les bords de la tache et mise en retrait de la fenêtre avec un Kimwipe. Définir la fenêtre sur une surface propre pour sécher.
Une fois que l’échantillon est sec, vérifiez la présence de cellules sur la fenêtre avec un microscope optique.
À l’aide de vernis à ongles transparent, fixer la fenêtre pour un support en aluminium.
Insérez le porte-échantillon dans la fixation de l’instrument, puis placer le support sur scène de positionnement des microscopes à rayons x.
Placer la fenêtre de l’échantillon au point focal de l’optique du microscope à rayons x, avec un angle de 45 degrés au faisceau incident.
Sortir de la zone de l’instrument et effectuer les étapes restantes à distance afin de minimiser l’exposition aux rayons x.
Ouvrir l’obturateur et permet de concentrer le faisceau de rayons x monochromatique jusqu'à une taille de tache sous micromètre optique.
La position de la tache peut être photographiée avec un appareil calibré. Utilisez les étapes de localisation, déterminer approprié width et height pour raster sur l’échantillon.
Recueillir un spectre pour l’essai de l’élément d’intérêt avec un temps de pause de 1 à 2 secondes.
Dans le spectre de test, choisissez un temps d’acquisition appropriée afin de fournir un rapport signal-bruit suffisant pour les éléments d’intérêt.
Ensuite, déterminez la résolution nécessaire pour l’échantillon. La résolution doit être plus petit que les caractéristiques d’intérêt, mais plus grand que la taille du spot. Enfin, programmer la numérisation dans le logiciel de numérisation et de recueillir l’image.
Dans cette expérience, une carte élémentaire d’une cellule a été réalisée pour plusieurs éléments différents. Beaucoup de métaux, tels que le cuivre, le fer et zinc est des substances nutritives dans la cellule et ont été clairement identifiés au sein de la cellule.
En déterminant où que chaque métal est trouvé dans la cellule, des informations précieuses peuvent être élucidées sur ses processus cellulaires normaux. En outre, les maladies à base de métal peuvent être comprises.
Fluorescence des rayons x est utilisé dans un large éventail de domaines scientifiques. La nature non destructifs de FRx permet son utilisation dans l’étude des artéfacts historiques. Historiens de l’art d’utiliser la technique pour déterminer les pigments utilisés à l’origine d’oeuvres d’art. Cela peut élucider des informations sur les activités, telles que la provenance, les couleurs qui ont disparu avec le temps et l’authenticité. Légistes utilisent également XRF dans l’investigation de scène de crime. Lorsqu’une arme à feu est déclenché, la région environnante est revêtue de résidu de coup de feu. Résidus de tir pistolet contient la poudre à Canon, amorce d’allumage et du metal de l’enveloppe et la balle. L’information recueillie au XRF peut identifier le coupable et l’arme utilisée.
Un autre domaine d’études qui se prête à la fluorescence x est paléontologie. Ici, une information élémentaire est récoltée dans un fossile de trilobite, un arthropode marin qui a vécu il y a plus de 250 millions ans.
En caractérisant la composition élémentaire des fossiles, nouvelles informations peuvent être obtenues sur la vie depuis longtemps disparue. Échantillons de nombreuses peuvent même fournir la composition des tissus mous qui se sont détériorées il y a longtemps.
Vous avez juste regardé introduction de JoVE à fluorescence x. Vous devez maintenant comprendre la théorie de la spectroscopie des rayons x et la collecte des informations élémentaires d’un large éventail de sources.
Merci de regarder !
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Results
La carte de fluorescence de rayons x d’une cellule adhérente est illustrée à la Figure 1. Chaque panneau présente la répartition d’un élément particulier (par exemple, cuivre, fer, zinc, etc.) sur la cellule. Le panneau intitulé « s_a » montre l’absorption des rayons x.
Figure 1. Carte de fluorescence de rayons x d’une cellule adhérente. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Applications and Summary
Imagerie de fluorescence de rayons x peut être un outil utile dans de nombreux domaines, y compris les sciences forensiques, géosciences, biologie, science des matériaux et même dans l’étude de notre patrimoine culturel. En science des matériaux, il peut aider à trouver des défauts en copeaux et catalyseurs faites avec des métaux. Travaux de patrimoine culturel, il a servi à identifier les métaux toxiques dans les cheveux de célébrités mortes (p. ex., Beethoven) et d’identifier la source des peintures utilisées dans l’art. En biologie, il est utilisé pour étudier les métaux naturels qui effectuent la biochimie important. En sciences de la terre, il est souvent utilisé pour étudier les événements relatés dans le dossier rock. Deux caractéristiques particulières qui rendent l’imagerie de fluorescence de rayons x utiles dans donc beaucoup de domaines est 1) son non destructive, ainsi que bon nombre des éléments qui sont rare, ou de valeur élevée peut être photographiée et 2) alors que la préparation des échantillons décrite ici pour les cellules est complexe, car les cellules doivent être séchées-pour nombreux matériaux tels que des roches, art ou autres articles, il y a très peu de préparation échantillon requis , autres qu’il doit être plat et exempt de poussière. Un synchrotron est obligatoire qui est le mieux accessible grâce à la collaboration avec des scientifiques de ces installations, la technique peut être très accessible.
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