Overview
Fuente: Laboratorio del Dr. Lydia Finney, laboratorio nacional de Argonne
Fluorescencia de rayos x es una radiación inducida, emitida que puede utilizarse para generar la información espectroscópica. Microscopía de fluorescencia de rayos x es una técnica no destructiva que utiliza la emisión de fluorescencia inducida de metales para identificar y cuantificar su distribución espacial.
Principles
En primer lugar, deben prepararse las muestras que son fino, plano y seco (a menos que una etapa criogénica especial está disponible para el microscopio). A continuación, un concentrado haz de rayos x monocromático es raster escaneados a través de la muestra. El haz de rayos x supera la energía de enlace de algunos de los electrones de la cáscara interna a los átomos de metal, y cuando caen los electrones de la cáscara externa en las vacantes, la muestra emite una segunda radiografía. En cada punto de este raster-scan, un espectro de emisión de fluorescencia de rayos x son recogido por el detector.
En este espectro, se registra la longitud de onda y la intensidad de todos los rayos x emitidos por la muestra. Basado en la energía característica (debido a la separación de las órbitas en el átomo) de la fluorescencia emitida y la característica intensidad relativa de Kα y Kβ picos (por ejemplo, que ambos conocen), el espectro de emisión puede utilizarse para determinar la identidad de los metales presentes y la cantidad.
Este video le explicará el proceso de preparación de una muestra delgada y seca de células adherentes adecuadas para imágenes de fluorescencia. Se explicará brevemente el proceso de análisis de las muestras, y se describe una imagen de ejemplo.
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Procedure
1. preparación de las ventanas de nitruro de silicio
- Use pinzas atrás para recoger una ventana (windows se rompen si cayó del nitruro de silicio).
- Coloque la ventana en un portaobjetos de vidrio, cara plana hacia arriba.
- Se adhieren pequeños trozos de cinta adhesiva a los lados de la ventana y utilizar éstos para cumplir las ventanas en la parte inferior de la placa de cultivo.
- Esterilizar las ventanas en los platos de la cultura con la radiación UV. Esto se puede lograr con el ajuste de auto-reticulación en un gabinete de reticulación UV, seguido por la irradiación UV más debajo de la lámpara de rayos UV en la campana de flujo laminar durante aproximadamente 1 hora.
2. las células en las ventanas de nitruro de silicio esterilizada de la galjanoplastia
- Sostenga el plato se inclina en un ángulo 45°.
- Añadir medios transfiriendo hacia el lado del plato y aliviar poco a poco el ángulo de inclinación para cubrir la ventana con los medios de comunicación.
- Añadir las células a la placa de cultivo, de la misma manera e incubar.
- Observar las células de vez en cuando con un microscopio de luz para determinar cuándo está listos para usar.
3. fijación y secado de las células
- En campana de flujo laminar, eliminar los medios de comunicación por aspiración suave mientras se inclina el plato como se describió anteriormente.
- Añadir PBS, pipeteo hacia el lado del plato mientras sostiene en ángulo. Aliviar poco a poco el ángulo de inclinación para cubrir la ventana con PBS.
- Retirar el PBS con aspiración suave.
- Pipeteado hacia el lado del plato y se mantiene en un ángulo, añaden 4% PFA/PBS, pH 7 para cubrir las células. Mantener en esta solución durante 20 minutos a temperatura ambiente.
- Retire la mezcla PFA/PBS y desechar como material peligroso.
- Añadir PBS, pipeteo como se describió anteriormente.
- Repita los pasos del 3.5 y 3.6 dos veces.
- Retirar el PBS por aspiración suave.
- Añadir tubos de 20 mM, 200 mM sacarosa, pH 7.
- Quite la tubos/sacarosa por aspiración suave.
- Repita los pasos del 2.8 y 2.9 dos veces.
- Rápidamente borra los bordes y detrás de la hendidura de la ventana con un Kimwipe, luego establecer la ventana en una superficie limpia, como una estera de rejilla de goma, para secar.
4. radiografía proyección de imagen de fluorescencia de las células
- Una vez seca la muestra, verificar la presencia de células en las ventanas utilizando un microscopio de luz.
- Use esmalte de uñas para asegurar las ventanas a un soporte de aluminio suministrado por la línea.
- Inserte el soporte de aluminio en un montaje cinemático y colocarla en su posición en el punto focal de la óptica en el microscopio de rayos x y en un ángulo de aproximadamente 45° al haz incidente de rayos x, montado en las etapas de nanopositioning de muestra.
- Salir de la zona del instrumento del microscopio de rayos x (generalmente un aparador hecho de paredes de plomo) y abra el obturador. Llevar a cabo los pasos restantes remotamente.
- Usando una placa de la zona, o espejos de Kirkpatrick-Baez, enfocar el haz monocromático de rayos x (generalmente 10 keV de energía) hasta un tamaño de punto de sub-micron.
- Utilizando las etapas de la muestra de nanopositioning y ver la posición del haz de rayos x en la muestra con una cámara Pre-calibrada scintillator aguas abajo, determinan el adecuado ancho y alto de la exploración de trama con el fin de capturar los datos de la muestra.
- Con el detector de longitud de onda dispersiva silicio deriva a 90° para el haz incidente y unos 3 mm o menos de la muestra, recoge un espectro de prueba con un tiempo de permanencia de 1 – 2 seg.
- Ver el espectro de prueba, elija un tiempo adecuado para la exploración, para proporcionar suficiente señal a ruido para los elementos de interés.
- Elegir una resolución adecuada para la exploración, que no es significativamente más pequeño que el tamaño del punto de la viga sobre la muestra, ni más grande que las características de interés en la muestra.
- Programar el análisis en el software de escaneado y recoger la imagen.
Fluorescencia de rayos x, o XRF, la espectroscopia es una técnica analítica no destructiva que se utiliza para realizar el análisis elemental de muestras a temperatura ambiente.
XRF puede aplicarse a una amplia gama de muestras, incluyendo biológicos, forenses, ambientales e incluso obras de arte. Las muestras también pueden tomar una variedad de formas, tales como polvos y cristales líquidos. En XRF, una muestra es bombardeada con un haz de rayos x haciéndolo emitir rayos x secundarios en una energía más baja, que se llama radiación fluorescente.
Aunque se refiere a como una técnica de fluorescencia, XRF difiere de microscopía de fluorescencia tradicional no utiliza luz visible de menor energía, o las moléculas de luz activo.
Este video se introducen los conceptos básicos de XRF y demostrar cómo recopilar mapas elementales de una muestra biológica.
Cuando un fotón de suficiente energía choca con un átomo, la energía es absorbida, emocionante de uno de los electrones de la cáscara externa. Cuando el electrón se relaje, emite un fotón secundario, por lo general de menor energía. Este proceso se conoce como fluorescencia. A diferencia de los fotones de baja energía, como los que se utilizan en microscopía de fluorescencia, rayos x fotones son energéticos totalmente expulsar electrones firmemente sostenidos de una cáscara interna. Un electrón de una cáscara de la alto-energía entonces caerá en la vacante. Se libera un fotón proporcional a la diferencia de energía entre las dos cáscaras. Cada elemento emite un único conjunto de fotones, o espectro, que puede utilizarse para identificar el elemento y determinar la cantidad presente. Este fenómeno se conoce como fluorescencia de rayos x.
Una vez que se ha recogido un espectro elemental, las señales de elementos de interés pueden ser aisladas. Las medidas pueden tomarse en varias ubicaciones a través de una muestra, generando una imagen, un píxel a la vez. Este proceso se conoce como análisis de la trama. Imágenes de todos los elementos de interés pueden ser generados posteriormente. Estos mapas elementales proporcionan información valiosa sobre la muestra. Con una comprensión de XRF, ahora estás listo para preparar una muestra biológica de la célula para generar mapas de elementales.
Para empezar, en primer lugar preparar y esterilizar una ventana de nitruro de silicio, que llevará a cabo la muestra en lugar de la exploración. Tenga cuidado, ya que son muy frágiles. Oriente la ventana por lo que es el lado plano hacia arriba. Luego colocar la ventana en una placa de cultivo, y apegarse al plato con trocitos de cinta adhesiva.
Por último, esterilizar la ventana de nitruro de silicio con la radiación UV durante 1 hora.
Ahora que la ventana ha sido esterilizada, la muestra puede ser fijo a él. En primer lugar, mantenga la placa de cultivo a un ángulo y agregar medios al lado del plato. Aliviar lentamente la inclinación hasta cubrir la ventana. Añadir las células al plato de la misma manera e incubar.
Observar periódicamente las células bajo un microscopio de luz hasta que estén listos para su uso.
En campana de flujo laminar, Aspire suavemente los medios de comunicación de la fuente.
Luego, enjuague las células con solución salina amortiguada de fosfatos para eliminar exceso de medios.
Aspire el PBS y fijar las células con paraformaldehido. Después de 20 min, retirar la mezcla y disponer como desechos peligrosos.
Quitar la ventana de la fuente y borrar los bordes y rápidamente detrás de la hendidura de la ventana con un Kimwipe. Coloque la ventana en una superficie limpia para secar.
Una vez seca la muestra, verificar la presencia de células en la ventana con un microscopio de luz.
Con esmalte de uñas transparente, fije la ventana a un soporte de aluminio.
Inserte el soporte de la muestra en el soporte del instrumento, luego coloque el soporte en la etapa de posicionamiento de los microscopios de rayos x.
Posición de la ventana de muestra en el punto focal de la óptica de microscopio de rayos x, con un ángulo de 45 grados a la viga de incidente.
Salir de la zona de instrumento y realizar los pasos restantes remotamente para minimizar la exposición de rayos x.
Abra el obturador y utilizar la óptica para enfocar el haz de rayos x monocromático hasta un tamaño de punto del secundario-micrómetro.
La posición del punto puede ser reflejada con una cámara previamente calibrada. Utilizando las etapas de colocación, determinar la anchura adecuada y altura necesaria a la trama sobre la muestra.
Recoge una gama de prueba del elemento de interés con un tiempo de permanencia de 1 – 2 segundos.
En el espectro de la prueba, elija un tiempo de exploración apropiada para proporcionar una suficiente proporción de señal a ruido para los elementos de interés.
Luego, determinar la resolución necesaria para la muestra. La resolución debe ser más pequeño que las características de interés, pero más grande que el tamaño del spot. Finalmente, el análisis del programa en el software de escaneado y recoger la imagen.
En este experimento, se realizó un mapa elemental de una célula para varios elementos diferentes. Muchos metales, como cobre, hierro y zinc son nutrientes importantes en la célula y fueron claramente identificados dentro de la célula.
Determinando que cada metal se encuentra en la célula, puede ser aclarada información valiosa sobre los procesos celulares normales. Además, se pueden entender enfermedades base de metal.
Fluorescencia de rayos x se utiliza en una amplia gama de campos científicos. La naturaleza no destructiva del XRF permite su uso en el estudio de artefactos históricos. Los historiadores de arte utilizan la técnica para determinar los pigmentos utilizados originalmente en obras de arte. Esto puede aclarar información sobre el trabajo, como la procedencia, colores que se han desvanecido en el tiempo y la autenticidad. Los científicos forenses también utilizan XRF en investigación de escena del crimen. Cuando se dispara un arma, el área circundante está cubierto con pistola tiro de residuos. Pistola tiro residuo contiene pólvora, primer encendido y metal de la carcasa y la bala. La información recogida con XRF puede identificar el culpable y arma utilizada.
Otro campo de estudio que se presta para fluorescencia de rayos x es Paleontología. Aquí, se recoge información elemental de un fósil de trilobite, un artrópodo marino que vivió hace 250 millones años.
Por caracterizar la composición elemental de fósiles, puede obtenerse nueva información acerca de la vida largo extinta. Las muestras mejor conservadas pueden proporcionar incluso la composición de los tejidos blandos que hace mucho tiempo se han deteriorado.
Sólo ha visto la introducción de Zeus para fluorescencia de rayos x. Ahora debe comprender la teoría de la espectroscopía de rayos x y cómo recopilar información elemental de una amplia gama de fuentes.
¡Gracias por ver!
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Results
El mapa de fluorescencia de rayos x de una célula adherente se muestra en la figura 1. Cada panel muestra la distribución de un elemento determinado (por ejemplo, cobre, hierro, zinc, etcetera) en la célula. El panel con la etiqueta 's_a' muestra la absorción de rayos x.
Figura 1. Mapa de fluorescencia de rayos x de una célula adherente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Applications and Summary
Imágenes de fluorescencia de rayos x pueden ser una herramienta útil en muchos campos, incluyendo ciencia forense, ciencia de materiales, Geociencias, biología y aún en el estudio de nuestro patrimonio cultural. En ciencia de materiales, puede ayudar a encontrar defectos en chips y catalizadores con metales. En la obra de patrimonio cultural, se ha utilizado para identificar los metales tóxicos en los cabellos de las personas famosas (por ejemplo, Beethoven) y a identificar la fuente de pinturas utilizadas en el arte. En biología, se utiliza para el estudio de los metales naturales realizan bioquímica importante. En Geociencias, a menudo se utiliza para estudiar acontecimientos chronicled en el expediente de la roca. Dos características particulares que hacen imágenes de fluorescencia de rayos x útil en muchos campos son 1) su no-destructivo, por lo que muchos de los artículos que son raro, o de alto valor puede ser reflejada y 2) mientras que la preparación de la muestra se describe aquí de células es complejo, porque las células deben ser secados para muchos materiales tales como rocas, arte y otros artículos, hay muy poca preparación de la muestra requerida , que debe ser plana y libre de polvo. Aunque un sincrotrón se requiere que es mejor acceder a través de la colaboración con los científicos de estas instalaciones, la técnica puede ser muy accesible.
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