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Réaliser une chromatographie sur couche mince à une dimension
 
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Réaliser une chromatographie sur couche mince à une dimension

Overview

Source : Laboratoire de Dr. Yuri Bolshan — University of Ontario Institute of Technology

Chromatographie sur couche mince (CCM) est une méthode chromatographique utilisée pour séparer les mélanges de composés non volatils. Une plaque TLC se compose d’une fine couche de matériau adsorbant (phase stationnaire) fixée sur un support solid approprié tels que plastique, aluminium ou verre1. L’échantillon et la référence composés sont dissous dans un solvant approprié et appliqués près le bord inférieur de la plaque TLC en petites taches. La plaque TLC est développée en immergeant la partie inférieure dans le solvant de développement consistant en une phase mobile correspondante. Capillarité permet la phase mobile à déplacer vers le haut de la couche d’adsorbante. Comme le solvant se déplace vers le haut de la plaque de TLC, il porte en lui les composants de chaque spot et les sépare basé sur leurs interactions physiques avec les phases mobiles et stationnaires.

Principles

Chromatographie consiste à séparer un mélange de composés en distribuant les composants entre deux phases2. La phase stationnaire est fixée en place tandis que la phase mobile est autorisée de circuler à travers la phase stationnaire, supportant les composants du mélange avec elle. Les propriétés des composés tels que solubilité dans la phase mobile et la force d’interaction avec la phase stationnaire affectent le taux auquel ils sont transportés à travers le milieu. Différents types de composés ayant des propriétés physiques différentes, ils sont transportés à des vitesses différentes, permettant la séparation des composants d’un mélange.

Cette vidéo fera la démonstration de la séparation et la visualisation des mélanges de composés à l’aide de la technique de chromatographie sur couche mince unidimensionnel (TLC).

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Procedure

1. plaques de CCM

  1. Adsorbants communs pour TLC sont gel de silice, d’alumine et de cellulose. Plaques de CCM sont disponibles dans le commerce avec une variété de propriétés. Choisir une plaque TLC et coupez-le à la bonne taille (environ 5 cm x 5 cm est suffisant pour la plupart des applications). Pour verre dos plaques de CCM, marquer le verre à l’aide d’une règle et un coupe-verre, puis casser avec précaution le long de la ligne.

2. spotting

  1. Dissoudre l’échantillon dans un solvant approprié pour faire une solution à 1 % environ. Si possible, le solvant doit être non polaire. Fractions de chromatographie sur colonne et autres solutions diluées peuvent être utilisées sans dilution, si le soluté est présent à une concentration comprise entre 0,2 % et 2,0 %.
  2. Marquer la ligne de base avec un crayon environ 1,0 cm du bas de la plaque. Positionner le cm de taches au moins de 1.0 depuis le bord de la plaque et les étiqueter correctement.
  3. Des taches peuvent être appliqués à l’aide d’un capillaire de verre. Pour repérer la plaque TLC, trempez le capillaire dans la solution pour dessiner dans une petite quantité de liquide. Doucement toucher la pointe vers l’emplacement souhaité sur la plaque de TLC et retirez-le immédiatement.
  4. Vous pouvez également appliquer taches avec une seringue de microlitre en livrant environ 1 μL de solution pour chaque application.
  5. Taches peuvent être appliquées successivement à chaque endroit, en prenant soin de ne pas pour troubler la surface de l’adsorbant avec la longue-vue. Laisser le solvant à sécher entre les applications.

3. choix d’un solvant de développement

  1. Il est préférable d’utiliser le solvant moins polaire possible pour une bonne séparation. Les solvants pour TLC sont hexane, acétate d’éthyle, dichlorométhane et le méthanol (tableau 1).
  2. Un moyen facile de trouver une phase mobile correspondante est de plaque place le TLC auprès d’un échantillon. Appliquer suffisamment solvant directement sur place pour former un cercle de solvant 1 à 2 cm de diamètre. Marquer la circonférence du cercle. Après visualisation un solvant approprié montrera des anneaux bien séparées, avec l’anneau extérieur environ 50 % de la distance entre le centre et le front du solvant.
  3. Il peut être nécessaire d’ajuster la polarité de la phase mobile en choisissant deux solvants miscibles et les tester dans des proportions variables. Exemples de mélanges communs sont hexanes avec l’acétate d’éthyle et dichlorométhane avec du méthanol.

4. développement

  1. Placer la plaque TLC tachetée dans une chambre en développement contenant le solvant de développement approprié. La ligne de solvant doit être au-dessous de la ligne de base figurant sur la plaque de TLC.
  2. La chambre en développement peut être une boîte avec un couvercle ou un bécher recouvert de papier d’aluminium ou de film plastique. Utilisez le plus petit récipient disponible qui accueillera la plaque TLC.
  3. Ne laissez pas le solvant atteindre le bord supérieur de la plaque. Lorsque le front du solvant (la limite où la partie humide des extrémités adsorbantes) est 5 à 10 mm du haut de la plaque, retirez la plaque TLC de pays en développement de chambre et marquer le front du solvant avec un crayon avant que le solvant ne sèche.

5. visualisation

  1. Taches de couleur peuvent être visualisés immédiatement et marqués avec un crayon. Souvent, les taches ne sont pas visibles et doivent donc être visualisés par toute autre méthode.
  2. Souvent, l’adsorbant TLC contient un indicateur fluorescent. Des taches peuvent être visualisées à l’aide d’une lampe à main d’ultraviolette (UV). Composés qui étancher la fluorescence apparaîtront comme des taches foncées lorsque la plaque est irradiée par ondes courtes (254 nm) lumière UV. Composés fluorescents produira des points lumineux lorsque irradiés avec une lumière ultraviolette d’une longueur d’onde appropriée. Marquer le centre de chaque spot avec un crayon.
  3. Des taches peuvent également être visualisées en appliquant une visualisation réactif ou tache sur la plaque de TLC. Le réactif de visualisation peut être appliqué en plongeant la plaque dans le réactif ou en essuyant la plaque avec une boule de coton saturé avec un réactif non corrosif.
  4. Une solution à 20 % d’acide phosphomolybdique en éthanol est utile pour la visualisation de la plupart des composés organiques. Les taches apparaissent lors du chauffage de la plaque avec un pistolet à air chaud ou dans un four.
  5. Les autres réactifs peuvent servir pour la visualisation de certaines catégories de composés. Par exemple, ninhydrine réactif est utilisé pour la visualisation de l’acide aminé et 2, 4-dinitrophénylhydrazine pour les aldéhydes et cétones.

6. analyse

  1. Le facteur de retard (Rf) est le rapport entre la distance parcourue par un composé une assiette de TLC à la distance parcourue par le solvant. Cela peut être déterminé en mesurant la distance entre la ligne de base et le centre de la tache et en divisant la valeur de la distance entre la ligne de base et le front du solvant.
  2. Le Rf d’un composé est caractéristique de ses propriétés physiques et dépend de facteurs tels que température, taille de l’échantillon et épaisseur et l’activité de l’adsorbant, la température et la taille de l’échantillon.
  3. Pour confirmer qu’un inconnu est identique à un composé connu, une norme doit être repérée sur la même plaque de TLC. Des substances identiques auront la même caractéristique Rf.

Chromatographie sur couche mince, ou TLC, est une méthode chromatographique utilisée pour séparer les mélanges de composés non volatils, couramment utilisés en chimie organique.

TLC est effectuée sur une plaque de verre ou de plastique-dos. Une ligne de base est marquée sur la plaque, ainsi que des étiquettes. Le mélange en cours d’examen et la référence composés sont dissous dans un solvant approprié et appliqués près le bord inférieur de la plaque TLC en petites taches. La plaque est placée dans un bocal, et un solvant (la phase mobile) sépare le mélange basé sur les propriétés physiques de chaque composant.

Malgré le fait que les techniques de séparation plus lourd instrument ont pouvoir de résolution plus que TLC, c’est la vitesse et faible coût qui fait TLC une technique séduisante pour l’analyse qualitative on-the-fly. Cette vidéo fera la démonstration de la préparation, exploitation et analyse de chromatographie sur couche mince.

Des techniques chromatographiques comprennent une phase stationnaire et mobile. Dans TLC, la phase stationnaire est constituée d’une couche mince de matériel fixé à la plaque. La matière est une substance polaire, comme le gel de silice. La phase mobile est un liquide non polaire qui se déplace vers le haut de la couche d’adsorbante par capillarité. Comme la phase mobile se déplace vers le haut de la plaque, il fait glisser le long des composants de chaque spot, qui sont ensuite séparées basées sur la polarité.

Les composés qui sont moins polaires passera plus de temps dans la phase mobile tel qu’il est tiré vers le haut de la plaque. Composés qui sont plus polaires sont plus attirés par la phase stationnaire et seront déplacera donc pas vers le haut de la plaque pour autant.

La séparation a lieu dans un récipient en voie de développement. Il peut s’agir de bocaux avec des couvercles ou des gobelets recouverts de papier aluminium. Utilisez le plus petit récipient disponible qui accueillera la plaque TLC pour accélérer la séparation.

La phase mobile, ou solvant de développement, devrait être aussi non polaire que possible pour une bonne séparation. Montré qu'ici est une série d’eluotropic pour le gel de silice, une liste de mobile commun phases par ordre croissant de puissance extraction.

Un certain nombre de phases mobiles peut être analysé simultanément. Sur une assiette propre, repérer l’échantillon dissous plusieurs fois, espacées d’au moins 2 cm. Appliquer la phase assez mobile à chaque endroit pour former un cercle de 1-2 cm de diamètre.

Marquer la distance parcourue par la phase mobile. Si la phase mobile n’est pas assez polaire, l’échantillon reste à proximité de l’endroit initial. Si la phase mobile est trop polaire, totalité de l’échantillon va migrer avec le front du solvant. Une phase mobile correspondante indiquera des anneaux bien séparées, avec l’anneau extérieur environ 50 % de la distance et le front du solvant.

Si nécessaire, deux phases mobiles miscibles peuvent être mélangés dans des proportions variables pour obtenir les propriétés voulues. Ici, un mélange de 1:1 de l’acétate d’éthyle et l’hexane a été trop polaire, mais une 01:20 mélange separa de manière appropriée.

Avec la phase mobile choisie, vous êtes prêt à commencer à développer la plaque.

Pour commencer la procédure, couper une plaque TLC disponible dans le commerce à la taille désirée. Si la plaque a un verre de sauvegarde, le score avec une pause le long de la ligne de coupe-verre et soigneusement.

Avec un crayon, marquer une ligne de base environ 1 cm du bas de la plaque. Marquer l’emplacement où les échantillons seront être repérés le long de la ligne. Veillez à ce que les taches sont au moins 1 cm du bord et 3 millimètres. Les étiqueter correctement.

Échantillons solides doivent être dissous dans un solvant approprié. Les solvants sont hexanes, acétate d’éthyle ou dichlorométhane. Utiliser le solvant moins polaire qui se dissout à l’échantillon.

Dresser le mélange solvant/échantillon avec un verre capillaire. Doucement toucher la pointe vers l’emplacement souhaité sur la plaque de TLC et retirez-le immédiatement. Il est important de ne pas déranger la phase stationnaire.

Garder l’endroit aussi petit que possible, car cela conduit à une meilleure séparation. Si plus d’échantillon est nécessaire, des taches peuvent être appliquées successivement à chaque emplacement. Laisser le solvant à sécher entre les applications. Un courant d’air peut être utilisé pour sécher des solvants moins volatils.

La plaque TLC est maintenant prête à être mis au point. Placez un morceau de papier filtre au fond du pot pour augmenter la pression de vapeur. Ajouter la phase mobile jusqu'à une profondeur qui n’atteint pas le niveau de référence. Cap le pot lorsque vous ne l’utilisez donc les vapeurs de solvants n’échappent pas.

Placez soigneusement la plaque de TLC tachetée dans le bocal en voie de développement. Assurez-vous que la phase mobile est au-dessous du niveau de base. Surveiller la progression du front de solvant — le bord d’attaque de la phase mobile — comme il se déplace rapidement vers le haut de la plaque.

Ne laissez pas la phase mobile atteindre le bord supérieur de la plaque, car bandes échantillon commencera à développer par l’intermédiaire de diffusion. Une fois que le front de solvant rapproche du haut, retirez la plaque de la chambre de pays en développement et marquer le front du solvant avec un crayon avant que le solvant ne sèche.

Si les composés ne sont pas colorées, une lampe UV permet de visualiser les taches. Le composé se bloquera la fluorescence de fond de la plaque. Mettre le feu à la mise en ondes courtes et éclairer la plaque sèche. À l’aide d’un crayon, un aperçu des taches visibles sous la lampe. À l’aide d’un crayon, un aperçu des taches visibles sous la lampe.

Une autre technique de visualisation possible consiste à utiliser le permanganate de potassium, un agent oxydant. À l’aide de pinces à épiler, plonger la plaque dans la tache du permanganate.

Retirer et tamponnez solution excès away avec du papier absorbant. Dans une hotte aspirante, soigneusement faire chauffer la plaque avec un pistolet thermique pour visualiser les spots. Utilisez un crayon pour marquer toutes les taches qui apparaissent.

Une fois que les taches ont été visualisées, la substance d’intérêt peut être comparée aux normes, comme illustré ici. Dans cet exemple, l’inconnu est de 1, 3-diphenylpropynone, un bloc de construction en synthèse organique. En comparant la bande à un standard connu et chlorure de benzoyle, un des produits de départ, le produit peut être identifié.

Le facteur de retard, ou Rf, sert à identifier la substance inconnue. La Rf est le rapport entre la distance parcourue par un composé une assiette de TLC à la distance parcourue par la phase mobile. Le facteur est déterminé en mesurant la distance entre la ligne de base à l’endroit et en divisant par la distance entre la ligne de base et le front du solvant.

La Rf d’un composé donné dépend des conditions utilisées pour l’expérience, y compris le choix de solvant, épaisseur et l’activité de l’adsorbant, la température et la taille de l’échantillon. Il faut pour assurer la cohérence entre les expériences de ces facteurs.

Vous avez juste regardé introduction de JoVE pour chromatographie sur couche mince. Vous devez maintenant comprendre la théorie sous-jacente de la séparation, comment choisir une phase mobile appropriée pour votre expérience et comment mettre en place et faire fonctionner une plaque TLC. Merci de regarder !

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Results

Un exemple d’une plaque de TLC typique est montré à la Figure 1. Un composé inconnu « A » peut être comparé à des normes connues « B » par « E ». Détermination de la valeur de Rf pour chacun des composants est réalisée par taches de chaque composé respectif, développer la plaque TLC et visualisation. Le Rf de composé inconnu « A » est calculé en mesurant la hauteur spot (y) et en divisant par la hauteur de solvant (z). En comparant cette valeur à la Rf déterminé pour chacune des normes permet d’identifier la substance inconnue.


Figure 1. Schéma d’une plaque TLC. Le facteur de retard (Rf) doit être cohérent entre les expériences tant que les conditions sont maintenues constantes.


Tableau 1. Eluotropic série de silicagel. Une liste de mobile commun phases par ordre croissant de puissance élution.

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Applications and Summary

TLC a un certain nombre d’applications pratiques en laboratoire. TLC peut être utilisé pour identifier des composés inconnus et inconnus des composants des mélanges par comparaison avec les normes. TLC est couramment utilisé pour suivre le cours d’une réaction chimique et d’évaluer la pureté du produit par le biais de la comparaison des quantités relatives des réactifs, produits et sous-produits sur chromatogrammes successifs au fil du temps. TLC peut également servir pour déterminer si une substance purifiée par d’autres méthodes (par exemple la recristallisation ou distillation) contient encore une quantité importante d’impureté.

Lorsque des composés similaires ne peuvent être résolus avec TLC, ils peuvent être séparés davantage basé sur une autre propriété physique, connue comme une séparation en deux dimensions. Par exemple, TLC a été utilisé pour séparer les classes large de lipides (triglycérides, stérols, acides gras, etc.), sécrétées par les glandes sébacées chez les mammifères. Les différentes classes ont été ensuite séparées par spectrométrie de masse3.

En microbiologie, TLC est utilisé dans les projections bioautographie pour roman antimicrobien à base de plantes composés de4. Une fois que les composés ont été séparés dans un extrait de la plante en question, les bandes peuvent être appliqués directement sur les cultures microbiennes. Les bandes qui sont observés pour inhiber la croissance sont ensuite ré-examinées comme candidats probables.

TLC est une méthode simple pour déterminer une phase mobile appropriée pour la séparation d’un mélange par chromatographie sur colonne. En outre, il est utilisé pour déterminer la composition des diverses fractions collectées pendant une séparation de chromatographie sur colonne, afin que les fractions contenant le composé désiré peuvent être identifiées et perçues.

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References

  1. Lehman, J. W. The student's lab companion: laboratory techniques for organic chemistry: standard scale and microscale. Pearson College Div, (2008).
  2. Pavia, D. L., Lampman, G. M., Kriz, G. S., & Engel, R. G. Microscale and Macroscale Techniques. Thomson Wadsworth, (2006).
  3. Pannkuk, E. L., Risch, T. S., Savary, B. J. Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (79), e50757, (2013).
  4. Kagan, I. A., Flythe, M. D. Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds. J. Vis. Exp. (85), e51411, (2014).

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