Overview
Fuente: Laboratorio del Dr. Yuri Bolshan, Instituto de tecnología de la Universidad de Ontario
Cromatografía en capa fina (TLC) es un método cromatográfico para separar mezclas de compuestos no-volátiles. Una placa de TLC consiste en una capa delgada de adsorbente material (la fase estacionaria) fijado a un soporte sólido apropiado como plástico, aluminio o vidrio1. Las muestras y referencia, establecidos son disueltos en un disolvente apropiado y aplicados cerca del borde inferior de la placa de TLC en pequeñas manchas. La placa de TLC es desarrollada por sumergir el borde inferior en el solvente en desarrollo que consta de una fase móvil adecuada. Acción capilar permite que la fase móvil mover hacia arriba la capa de adsorbente. Como el solvente se mueve hacia arriba de la placa de TLC, se lleva consigo los componentes de cada punto y se separa en sus interacciones físicas con las fases móvil y estacionarias.
Principles
Cromatografía consiste en la separación de una mezcla de compuestos mediante la distribución de los componentes entre dos fases2. La fase estacionaria se fija en su lugar mientras que la fase móvil se permite que fluya a través de la fase estacionaria, llevar los componentes de la mezcla con él. Las propiedades de compuestos tales como solubilidad en la fase móvil y la fuerza de interacción con la fase estacionaria afectan la tasa a la que se realizan a través del medio. Puesto que diferentes tipos de compuestos tienen propiedades físicas diferentes, se realizan a diferentes velocidades lo que permite la separación de los componentes de una mezcla.
Este video demuestra la separación y visualización de las mezclas de compuestos mediante la técnica de cromatografía en capa fina unidimensional (TLC).
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Procedure
1. TLC placas
- Adsorbentes comunes para TLC son gel de sílice, alúmina y celulosa. Placas de TLC están comercialmente disponibles con una variedad de propiedades. Elegir una placa de TLC y reducida a un tamaño apropiado (aproximadamente 5 cm x 5 cm es suficiente para la mayoría de las aplicaciones). Para vidrio-movió placas de TLC, marcar el vidrio usando una regla y un cortador de vidrio, luego romper cuidadosamente a lo largo de la línea.
2. manchado
- Disolver la muestra en un solvente adecuado para hacer una solución al 1% aproximadamente. Si es posible, el disolvente debe ser no polar. Fracciones de cromatografía de columna y otras soluciones diluidas pueden usarse sin dilución si el soluto está presente en una concentración entre 0.2% y 2.0%.
- Marque la línea de base con un lápiz cerca de 1,0 cm de la parte inferior de la placa. Posición de los puntos por lo menos 1.0 cm desde el borde de la placa y etiquetarlos adecuadamente.
- Puntos pueden aplicarse utilizando un capilar de vidrio. Para detectar la placa de TLC, sumerja el capilar en la solución para aspirar una pequeña cantidad de líquido. Suavemente de la punta hasta la posición deseada sobre la placa de TLC y retire inmediatamente.
- Como alternativa, aplicar puntos con una jeringa microliter entregando aproximadamente 1 μL de solución para cada aplicación.
- Puntos pueden ser aplicados sucesivamente en cada lugar, cuidando de no para perturbar la superficie del adsorbente con el observador. Deje que el solvente se seque entre aplicaciones.
3. elección de un solvente de desarrollo
- Es preferible usar el solvente menos polar posible para buena separación. Los solventes comunes para TLC son hexano, acetato de etilo, diclorometano y metanol (tabla 1).
- Una manera conveniente para encontrar una adecuada fase móvil es a punto del TLC la placa con una muestra. Aplique suficiente solvente directamente en el lugar para formar un círculo de solvente 1 – 2 cm de diámetro. Marcar la circunferencia del círculo. Sobre la visualización de un disolvente apropiado mostrará anillos bien separados, con el anillo exterior alrededor del 50% de la distancia desde el centro hasta el frente del solvente.
- Puede ser necesario ajustar la polaridad de la fase móvil eligiendo dos solventes miscibles y pruebas en proporciones variables. Ejemplos de mezclas comunes son hexanes con acetato de etilo y diclorometano con metanol.
4. desarrollo
- Coloque la placa de TLC manchada en una cámara de desarrollo que contiene el solvente de desarrollo apropiado. La línea solvente debe estar por debajo de la línea de base marcado en la placa de TLC.
- La cámara en desarrollo puede ser un tarro con una tapa o un vaso de precipitados cubierto con papel de aluminio o film plástico. Utilice el recipiente más pequeño disponible que se acomode la placa de TLC.
- No permita que el disolvente alcanzar el borde superior de la placa. Cuando el frente del solvente (el límite donde la parte húmeda de los extremos del adsorbente) es 5-10 mm desde la parte superior de la placa, retirar la placa de TLC de los países en desarrollo la cámara y marcar el frente del solvente con un lápiz antes de que se seque el disolvente.
5. visualización
- Manchas de color se pueden visualizar inmediatamente y marcados con un lápiz. A menudo, las manchas no son visibles y por lo tanto se deben visualizar con algún otro método.
- A menudo, el adsorbente de TLC contiene un indicador fluorescente. Puntos pueden ser visualizados usando una Hand-held lámpara ultravioleta (UV). Compuestos que apagan de la fluorescencia aparece como manchas oscuras cuando la placa se irradia con onda corta (254 nm) luz UV. Compuestos fluorescentes producen manchas cuando es irradiado con luz ultravioleta de una longitud de onda adecuada. Marque el centro de cada punto con un lápiz.
- Manchas también pueden ser visualizadas mediante la aplicación de un reactivo de visualización o mancha en la placa de TLC. El reactivo de visualización puede ser aplicado por inmersión de la placa en el reactivo, o limpiando el plato con una bola de algodón impregnado de un reactivo no-corrosivo.
- Una solución de ácido fosfomolíbdico en etanol 20% es útil para la visualización de los compuestos más orgánicos. Las manchas aparecen sobre calentamiento de la placa con una pistola de calor o en un horno.
- Otros reactivos pueden utilizarse para la visualización de las clases específicas de compuestos. Por ejemplo, reactivo de la ninhidrina se utiliza para la visualización del aminoácido y el 2, 4-dinitrofenilhidrazina para aldehídos y cetonas.
6. Análisis
- El factor de retardo (Rf) es el cociente de la distancia que un compuesto viaja encima de una placa de TLC a la distancia que viaja el solvente. Esto puede determinarse midiendo la distancia desde la línea de base hasta el centro del punto y dividir el valor de la distancia entre la línea de fondo y el frente del solvente.
- El Rf de un compuesto es característico de sus propiedades físicas y depende de factores como la temperatura, tamaño de la muestra y grueso y actividad del adsorbente, la temperatura y el tamaño de la muestra.
- Para confirmar que un desconocido es idéntico a un compuesto conocido, un estándar debe ser visto en la misma placa de TLC. Sustancias idénticas tendrá la misma característica Rf.
Cromatografía en capa fina o TLC, es un método cromatográfico para separar mezclas de compuestos no volátiles, de uso general en química orgánica.
TLC se realiza en una placa de respaldo de vidrio o plástico. Una línea de base está marcada en la placa, junto con las etiquetas. La mezcla se examina y referencia compuestos disueltos en un disolvente apropiado y aplicados cerca del borde inferior de la placa de TLC en pequeñas manchas. La placa se coloca en un frasco, y un solvente (fase móvil) separa la mezcla basada en propiedades físicas de cada componente.
A pesar de que más técnicas de separación de instrumentos pesados tienen más energía que el TLC, es la velocidad y bajo costo hace TLC una técnica atractiva para el análisis cualitativo de on-the-fly. Este vídeo demuestra la preparación, operación y análisis de cromatografía en capa fina.
Técnicas cromatográficas incluyen una fase estacionaria y móvil. En TLC, la fase estacionaria consiste en una capa delgada de material fijado a la placa. El material es una sustancia polar, como gel de sílice. La fase móvil es un líquido no polar que se mueve hacia arriba de la capa de adsorbente por acción capilar. Como fase móvil se mueve hacia arriba de la placa, arrastra a lo largo de los componentes de cada lugar, que posteriormente son separados basados en polaridad.
Compuestos que son menos polares pasarán más tiempo en la fase móvil como se tira encima de la placa. Compuestos más polares son más atraídos por la fase estacionaria y por lo tanto, no se moverán hacia arriba de la placa de la medida.
La separación lleva a cabo en un contenedor en vías de desarrollo. Estos pueden ser frascos con tapas o vasos cubiertos con papel de aluminio. Utilice el recipiente más pequeño disponible que se acomode la placa de TLC para acelerar la separación.
La fase móvil, o en vías de desarrollo solvente, debe ser como no polar como sea posible para una buena separación. Se muestra que aquí es una serie de eluotropic de gel de silicona, una lista de móviles comunes fases en orden creciente de energía de extracción.
Se puede probar simultáneamente un número de fases móviles. En un plato limpio, observar la muestra disuelta en múltiples ocasiones, por lo menos 2 cm de separación. Fase lo suficientemente móvil se aplica a cada punto para formar un círculo de 1-2 cm de diámetro.
Marcar la distancia que viaja la fase móvil. Si la fase móvil no polar lo suficiente, la muestra permanecerá cerca del punto inicial. Si la fase móvil es también polar, todos de la muestra se migrarán con el frente del solvente. Una fase móvil apropiada mostrará anillos bien separados, con el anillo exterior alrededor del 50% de la distancia al frente del solvente.
Si es necesario, se pueden mezclar dos fases móviles miscibles en diversas proporciones para obtener las propiedades deseadas. Aquí, una mezcla 1:1 de acetato de etilo y hexano fue demasiado polar, pero un 1:20 mezcla apropiadamente fue separada.
Con la fase móvil elegida, listo empezar a desarrollar la placa.
Para comenzar el procedimiento, cortar una placa de TLC comercialmente disponible al tamaño deseado. Si el plato tiene un cristal forro, cuenta con un cortador de vidrio y con cuidado romper a lo largo de la línea.
Con un lápiz, marque una línea de base 1 cm desde la parte inferior de la placa. Marque el lugar donde las muestras se ver a lo largo de la línea. Asegúrese de que las manchas son por lo menos 1 cm del borde y 3 mm de separación. Etiquetarlos adecuadamente.
Muestras sólidas deben disolverse en un solvente adecuado. Solventes comunes incluyen hexanes, acetato de etilo o diclorometano. Utilice el solvente menos polar que se disuelve la muestra.
Elaborar la mezcla muestra/disolvente con un capilar de vidrio. Suavemente de la punta hasta la posición deseada sobre la placa de TLC y retire inmediatamente. Es importante no molestar a la fase estacionaria.
Mantener el lugar tan pequeño como sea posible, mientras que esto conduce a una mejor separación. Si se necesita muestra más puntos pueden aplicarse sucesivamente en cada lugar. Permita que el disolvente se seque entre aplicaciones. Una corriente de aire se puede utilizar para secar solventes menos volátiles.
La placa de TLC está ahora lista para ser desarrollado. Coloque un pedazo de papel de filtro en la parte inferior de la jarra para aumentar la presión de vapor. Añadir la fase móvil a una profundidad que no alcanza la línea de base. Tapa de la jarra cuando no esté en uso para que no escapen los vapores del solvente.
Con cuidado coloque la placa de TLC manchada en la jarra en vías de desarrollo. Asegúrese de que la fase móvil está por debajo de la línea de base. Ver el avance del frente del disolvente, la vanguardia de la fase móvil, como se moverá rápidamente para arriba de la placa.
No permita que la fase móvil alcanzar el borde superior de la placa, como bandas de la muestra comenzará a expandirse por difusión. Una vez que el frente del disolvente se acerca a la parte superior, retire la placa de la cámara en desarrollo y marque el frente del disolvente con lápiz antes de que se seque el disolvente.
Si los compuestos no son coloreados, una lámpara ultravioleta puede utilizarse para visualizar los puntos. El compuesto bloquea la fluorescencia del fondo de la placa. Coloque la lámpara en el valor de la onda corta y se ilumina la placa seca. Utilizando un lápiz, delinear cualquier manchas visibles debajo de la lámpara. Utilizando un lápiz, delinear cualquier manchas visibles debajo de la lámpara.
Otra técnica posible de visualización es usar permanganato de potasio, un agente oxidante. Con unas pinzas, sumerja la placa en la mancha de permanganato.
Retire y frote lejos exceso de solución con una toalla de papel. En una campana de humos, calentar cuidadosamente la placa con una pistola de calor para visualizar los puntos. Use un lápiz para marcar cualquier manchas que aparecen.
Una vez que los puntos han sido visualizados, la sustancia de interés puede ser comparada con estándares, como se muestra aquí. En este ejemplo, lo desconocido es 1, 3-diphenylpropynone, un bloque de creación en síntesis orgánica. Mediante la comparación de la banda a un estándar conocido y cloruro de benzoilo, una de las materias primas, el producto puede ser identificado.
El factor de retraso, o Rf, se utiliza para identificar el compuesto desconocido. El Rf es el cociente de la distancia que viaja un compuesto por una placa de TLC a la distancia que viaja la fase móvil. El factor se determina midiendo la distancia desde la línea de base hasta el lugar y dividiendo por la distancia entre la línea de fondo y el frente del solvente.
Rf de un compuesto dado depende de las condiciones utilizadas en el experimento, incluyendo la opción solvente, espesor y la actividad del adsorbente, la temperatura y el tamaño de la muestra. Debe tener cuidado de mantener estos factores consistentes entre experimentos.
Sólo ha visto la introducción de Zeus para cromatografía en capa fina. Ahora debería entender la teoría subyacente de la separación, cómo elegir una fase móvil adecuada para su experimento y cómo configurar y utilizar una placa de TLC. ¡Gracias por ver!
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Results
En la figura 1se muestra un ejemplo de una típica placa de TLC. Una compuesto desconocida 'A' puede ser comparada con estándares conocidos 'B' a 'E'. Determinación del valor de Rf para cada componente se consigue manchas de cada compuesto respectivo, desarrollo de la placa de TLC y visualización. El Rf del compuesto desconocido 'A' se calcula midiendo la altura del punto (y) y dividiendo por la altura (z) del solvente. Comparando este valor al Rf determinado para cada uno de los estándares permite la identificación del compuesto desconocido.
Figura 1. Esquema de una placa de TLC. El factor de retardo (Rf) debe ser coherente entre experimentos mientras las condiciones se mantienen constantes.
Tabla 1. Eluotropic serie de Gel de sílice. Una lista de móviles comunes fases en orden creciente de poder liberador.
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Applications and Summary
TLC tiene un número de aplicaciones prácticas en el laboratorio. TLC puede ser utilizado para identificar compuestos desconocidos y desconocidos componentes de mezclas a través de la comparación con estándares. TLC se utiliza comúnmente para controlar el curso de una reacción química y para evaluar la pureza del producto a través de la comparación de cantidades relativas de reactivos, productos y subproductos en cromatogramas sucesivos en el tiempo. TLC también puede utilizarse para determinar si una sustancia purificada por otros métodos (como la recristalización o destilación) todavía contiene una cantidad significativa de impurezas.
Cuando compuestos similares no pueden ser resueltos con TLC, puede separar más basan en otra propiedad física, conocida como una separación de dos dimensiones. Ejemplo, TLC se utiliza para separar clases amplio de lípidos (triglicéridos, esteroles, ácidos grasos, etc.) secretadas por glándulas sebáceas mamíferas. Las diferentes clases más luego fueron separadas por espectrometría de masas3.
En microbiología, TLC se utiliza en exámenes de bioautografía a nuevos antimicrobianos basados en plantas compuestos4. Una vez que los compuestos han sido separados de un extracto de la planta en cuestión, las bandas pueden aplicarse directamente a cultivos microbianos. Bandas que se observan para inhibir el crecimiento entonces se estudian más como probables candidatos.
TLC es un método sencillo para determinar una fase móvil adecuada para la separación de una mezcla por cromatografía en columna. Además, se utiliza para determinar la composición de las diferentes fracciones recogidas durante una separación de la cromatografía de columna, para que fracciones que contiene el compuesto deseado pueden ser identificados y recogidos.
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References
- Lehman, J. W. The student's lab companion: laboratory techniques for organic chemistry: standard scale and microscale. Pearson College Div, (2008).
- Pavia, D. L., Lampman, G. M., Kriz, G. S., & Engel, R. G. Microscale and Macroscale Techniques. Thomson Wadsworth, (2006).
- Pannkuk, E. L., Risch, T. S., Savary, B. J. Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (79), e50757, (2013).
- Kagan, I. A., Flythe, M. D. Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds. J. Vis. Exp. (85), e51411, (2014).
