Overview
Microarrays sont des outils importants pour le profilage de l’expression des gènes et reposent sur une liaison complémentaire entre les sondes qui sont attachées à des éclats de verre et d’acides nucléiques provenant d’échantillons. L’utilisation de ces tableaux, les scientifiques peuvent évaluer simultanément l’expression de milliers de gènes. En outre, les profils d’expression des différentes cellules ou les types de tissus peuvent être comparés, permettant ainsi aux chercheurs de déduire l’évolution de l’expression des gènes différents au cours de processus biologiques et ainsi mieux comprendre comment les gènes peuvent fonctionner dans des voies ou réseaux.
Ici, JoVE, explique les principes qui sous-tendent les microarrays. Elle est suivie par un protocole général pour réaliser une expérience de microarray et une brève introduction à l’analyse de données microarray. Nous terminons sur une discussion sur comment les scientifiques se servent actuellement de microarrays, par exemple, pour comparer l’expression des gènes entre les différents types de cellules provenant de tissus cancéreux et non cancéreuses, d’étudier les problèmes biologiques importantes.
Procedure
Puces à ADN sont des outils largement utilisés pour mesurer simultanément l’expression de nombreux gènes différents. Ils sont constitués de milliers de sondes — représentant chacun un gène différent — immobilisé sur « chips » ou de diapositives et s’appuient sur l’hybridation complémentaire afin d’évaluer l’expression des gènes dans des conditions biologiques différentes.
Cette vidéo couvre les principes fondamentaux de la technologie des puces, un protocole pour l’expression de gènes à l’aide de puces à ADN et certaines applications actuelles.
Commençons par examiner les principes de la technologie de profilage et de microarray d’expression des gènes.
Une des premières méthodes élaborées pour évaluer l’expression des gènes dans des échantillons biologiques est Northern blot, qui consiste à « sonder » pour des molécules d’ARN spécifiques immobilisés sur des membranes. Sondes « Flottants » reconnaissent des séquences d’ARN complémentaires dans l’échantillon et sont généralement étiquetés avec des molécules radioactives ou fluorescentes afin qu’elles peuvent être visualisées.
Avancées en microfabrication, séquençage du génome et d’autres technologies ont conduit au développement de la biopuce microarray. Comme Northern blots, microarrays reposent sur le principe de liaison complémentaire entre les séquences d’acides nucléiques de sonde et échantillon. Contrairement aux Brochets, cependant, dans les puces à ADN, c’est les sondes oligonucléotidiques qui sont immobilisées sur une lame de verre ou de la puce. Les échantillons « flottants » sont générés à partir des ARN isolé des cellules ou organismes d’intérêt, ce qui est inverse transcrit complémentaires ou « c »-ADN. Cela peut soit être marqué directement avec des molécules fluorescentes ou leurs montants peuvent être encore amplifiés par dans la transcription in vitro dans les cRNA. L’échantillon est ensuite hybridé à la puce. Parce que les sondes sur puces conçues pour différentes applications peuvent être « sens », qui signifie que leurs séquences sont dans la même direction comme un organisme exprimé ARN, ou « antisens », les chercheurs doivent s’assurer que la directionnalité de brin de l’échantillon est complémentaire à celle des sondes.
Les données d’intensité de fluorescence « brut » pour chaque point de gène-spécifique sur la puce peuvent alors être quantifiées et traitées. Les données peuvent être soumises à davantage de tests statistiques, comme test de t de l’élève, afin de déterminer si les signaux de la fluorescence — et donc les niveaux d’expression — pour un gène d’intérêt sont significativement différentes entre les deux types de cellules ou des conditions expérimentales.
Les chercheurs peuvent également utiliser ces données à des gènes « cluster » ou groupe d’issu des profils similaires d’expression. Par exemple, lors de la comparaison des profils d’expression entre les deux populations de cellules, certains gènes se trouvent en quantités à peu près équivalentes dans la même direction pour démontrer les modifications de l’expression et pourraient donc être regroupées. Chercheurs peuvent illustrer ces relations dans un type de diagramme en arbre ou « dendrogramme » où les hauteurs et les arrangements des « branches » indiquent comment similaires — ou non — sont des profils d’expression génique. Ce type d’analyse peut donner un aperçu de réseaux de gènes, comme « groupés » gènes peuvent participer dans les mêmes voies biologiques.
Maintenant que nous avons discuté des principes de la méthodologie « microarray », nous allons jeter un oeil à une expérience de microarray typique.
Pour assurer la qualité de l’ARN isolé, espaces de travail et de l’équipement doivent être traitées avec des produits chimiques qui inactivent les RNases — enzymes qui détruiraient sinon RNA. L’ARN est ensuite isolé d’échantillons d’intérêt et purifiée, et sa concentration et son intégrité sont déterminés par spectrophotométrie.
Cet ARN de l’échantillon est converti en ADNc, puis cRNA. Ensuite, l’échantillon est étiqueté avec des molécules fluorescentes et fragmenté, et sa qualité et sa quantité peut encore être vérifiée, date à laquelle l’étendue de marquage fluorescent peut également être évaluée.
Le cRNA étiquetée est ensuite mélangé avec « solution d’hybridation » avant du charger sur un microréseau. Afin de faciliter l’hybridation réussie, une « table de mixage » est placé sur la puce pour former « chambres à hybridation ». Le mélange de l’hybridation est ensuite lentement ajouté dans le tableau. Il faut pour éviter les bulles d’air, car ceux-ci peuvent interfère avec la liaison de l’échantillon à des régions spécifiques la biopuce et provoquer un faux signal négatif. Une fois que l’échantillon est ajouté, puces sont incubés à la bonne température pendant 24 heures.
Après hybridation, la table de mixage est supprimé de la puce, échantillon non lié est éliminé, et le tableau est soigneusement séché par centrifugation dans une centrifugeuse spécialisée, porte-diapositive. La puce séchée est insérée dans un scanner de microarray, et la machine est réglée pour que les signaux plus brillantes observées sur une puce ne sont pas trop saturées. La biopuce est ensuite scannée, et produit une image de la puce ensemble.
Une fois la puce a été scannée, le fichier image est chargé dans un logiciel d’extraction de données et évalué pour toute irrégularité de signal. Les données extraites de l’image de « microarray » sont soumises à un certain nombre de manipulations statistiques, y compris la transformation logarithmique2 , qui permet aux chercheurs de représenter numériquement données en termes de pli augmente ou diminue dans l’expression des gènes ; ainsi que de la normalisation, qui tient compte de la différence de signal entre les puces de microarray. Cela traitées les données peuvent alors être analysée plus loin.
Maintenant que nous avons démontré comment le profilage de l’expression avec les puces à ADN est effectué, nous allons étudier comment les microarrays peut être utilisées dans des expériences spécifiques.
Les chercheurs emploient souvent microarrays d’évaluer comment l’expression des gènes change tout au long d’un processus biologique, tels que la différenciation cellulaire. Ici, les scientifiques évalué les niveaux de micro-ARN, qui sont 22 nucléotides que petits ARN impliqués dans la mise au point d’expression des gènes, dans trois types de cellules humaines représentant différentes étapes de développement de la rétine. En comparant les microRNA expression entre ces cellules, les chercheurs ont pu identifier les gènes potentiellement impliqués dans le développement et la différenciation du tissu rétinien.
Puces à ADN permet également d’évaluer les différences d’expression entre différentes cellules ou les types de tissus. Dans cette expérience, un modèle de rongeur de stress post-traumatique, ou ESPT, a été créé par exposant des rats à des décharges électriques. Les neurones ont été prélevés dans différentes régions du cerveau et l’ARN a été isolé. Microarrays ont ensuite été utilisés pour identifier l’expression différentielle des gènes associés aux mitochondries dans ces neurones, donnant un aperçu sur les mécanismes moléculaires complexes derrière PTSD.
Enfin, chercheurs également postulez microarrays aux études sur le cancer, dans l’espoir que la nouvelle maladie biomarqueurs peuvent être identifiés. En raison des infections par des virus tout au long de notre évolution, génomes humains contiennent des séquences génétiques virus appelés « rétrovirus endogènes » ou vre, dont certains sont encore activement exprimés. Ici, l’expression de vre dans les tissus normales et cancéreuses de la prostate ont été comparés à l’aide de puces à ADN. Cette méthode a permis d’identifier plusieurs vre qui étaient surexprimés dans le cancer de la prostate, ce qui les rend des biomarqueurs potentiels qui peuvent être utilisés pour diagnostiquer la maladie.
Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur l’expression de gènes à l’aide de puces à ADN. Cette vidéo a couvert les principes de base de la technologie des puces, un protocole pour les applications de cette technique et profilage de l’expression. Comme toujours, Merci pour regarder !
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