RNA 的序列

Genetics

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Summary

不同方法评估基因表达,高通量测序的 RNA 或 RNA 序列是特别有吸引力,由于它可以表现,而不依赖于事先可用基因组信息分析。在 RNA 的序列,RNA 分离样品感兴趣的用于生成一个 DNA 库,这是然后扩增和测序。最终,RNA 序列可以确定哪些基因被表达,其表达,和任何以前未知的成绩单的存在水平。

在这里,朱庇特提出了 rna-seq 背后的基本原则然后,我们讨论一般的 RNA 序列协议的实验和分析步骤。最后,我们检查如何研究人员当前正在使用 RNA 序列,例如,若要比较基因表达之间不同的生物样品,或表征蛋白质-RNA 相互作用。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 遗传学精要. RNA 的序列. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

RNA 序列或 RNA 的序列,在一定数量的细胞是一种技术,可以提供有关信息的序列和数量的每个 RNA 表达,被称为"转录组,"。与其他表达谱芯片,涉及探测的已知的 RNA 序列,方法不同 RNA 序列可以配置文件从基因组未测序的生物基因的表达。另外,RNA 序列可以精确地测量更大范围的转录表达水平比微阵列技术,尤其是在很低或很高的水平。

这个视频将涵盖 RNA 的序列,为准备一个 RNA 序列库和分析数据和这种技术的一些应用协议的原则。

首先,让我们来回顾一些原则背后 RNA 序列转录组测序需要隔离的成绩单的水平是衡量人口。大多数 RNA 在细胞中的是核糖体 RNA 或 rRNA,细胞的蛋白质生产机械的核心部件。便于回收其他类型的成绩单,rRNA 是测序通常被删除的之前通过杂交互补的寡核苷酸连接到磁性珠的样品并使用磁铁分隔 rRNA 从剩下的采样。

或者,可以为测序选择特定人口的 RNA。例如,用"寡-dT"捕捉蛋白质编码的信使 Rna 或 mRNAs,— — 短 T 脱氧核苷酸绑定到这些成绩单末尾的多聚 A 尾巴被称为碱基序列的延伸。然后删除污染 rRNA。小分子 Rna,是 22-核苷酸监管 Rna,可以有选择性地分离为基于他们的大小排序。因为 RNA 是本质上易于降解,它是第一次反向转录到双链 DNA。

寡核苷酸序列称为适配器然后结扎到 DNA 片段上。适配器包含作为引物结合位点的后续 PCR 扩增的恒定区域,以便保存该模板的"链型",这些都是通常不对称。适配器也包含独特序列,称为"条形码",识别出所有的碎片,源自一个简单的示例。图书馆是然后 pcr 扩增。

测序芯片,上面有很寡核苷酸补充到适配器,用来固定图书馆样品,这样的 DNA 分子退火在低密度芯片上稀释。DNA 扩增的芯片通过这个过程被称为"桥放大"形成"无性系集群"。由一端或两端的这些 DNA 模板,生成数以亿计的产品称为测序读取然后合成短片段,长度,每个 30-150 基地。

测序结果然后分析质量和处理数据。序列分析可以揭示出种类繁多的信息,包括样品和以前未知的成绩单或形式的成绩单之间的 Rna 表达水平的差异。

现在,我们已看到 RNA 序列是如何工作的让我们去通过一项议定书为准备一个 RNA 序列库和分析序列数据。RNA 第一次索取样品感兴趣,并且其质量签电泳法,例如通过使用一种叫做光度计的微流体装置。RNA 必须是高质量的精确测序结果。以确保没有的 DNA 污染,RT PCR 对基因表达进行有或没有逆转录酶。逆转录酶的缺乏之处,应该是没有的产品。

若要选择多聚 A RNA,样品被绑定到寡 dT 探头连接到磁珠。所选的 RNA 碎片化到 200 核苷酸片断在高温镁离子存在下减少依赖长度的偏差在随后的反应和分析。碎片然后转换为双链 DNA 和适配器结扎。图书馆利用 PCR 扩增,和它的质量检查: ◆ 在通过执行 qPCR。◆ 结果应显示峰值的产品在预期的大小基于平均片段大小和长度的适配器。

图书馆从不同的样品,包含不同的条码适配器,可以混合在一起,同时参考添加低浓度作为后续步骤的质量控制的过程中,如克隆簇生成和测序反应的 DNA 样本。添加到测序芯片混合物并将其加载到这台机器。

在测序反应的 DNA 簇密度监测: 它必须不能过高,这可能会导致到交叉污染,或太低,从而导致数据不足。测序的质量,给出 Q 分值,指示正在确定不正确基地的可能性。大多数基地的 Q 得分应大于 30,为不正确的读取对应 1000年小于 1 的机会。复苏的预期速度参考 DNA 序列指示均匀地表示所有库序列。

读取由测序生成然后重叠与对方来推断出被测序的 RNA。为生物与基因组信息可用,读取可以对齐到参考基因组。每成绩单读取数来衡量每个 RNA 的丰度。

后看到 RNA 序列是如何工作的让我们看看它的正在使用的一些方式。

转录组测序可以确定下不同条件下差异表达的基因。例如,在此实验中,转录蚊子幼虫在不同生长条件下产生的对照。尽管这一特定种类的携带疾病的蚊子没有测序的基因组,研究者们能够比较获得转录组信息到其他已测序的物种,并确定基因与增加或减少的表达水平。

RNA 的序列也可以用于"大规模并行记者分析"研究基因调控机制。这是通过转染哺乳动物细胞与图书馆的数以千计的质粒,每个包含"驾驶"的加上一个记者序列转录于独特标记基因监管网站突变的变异。Rna 和高通量测序后,每个标记的水平进行评估来评价记者从每个构造,哪个给洞察功能重要性的核苷酸突变在每个监管网站变体的表达式。

最后,RNA 测序可以适应研究 RNA-蛋白质相互作用,尤其是以确定感兴趣的一种蛋白质将绑定到的成绩单。蛋白质是抗体的修剪和测序由定义的绑定的 Rna。如果 RNA-蛋白质复合物交联在开始时,测序分析可交联的站点映射和识别 RNA 核苷酸水平上的蛋白结合网站。

你刚看了 rna-seq 朱庇特的视频在这个视频中,我们已经看到如何将 RNA 样本转换成库,测序,和由此产生的数据进行了分析,以及测序分析,可以提供的信息的类型。由于其敏感性,可用于任何一种生物和测序,降低的成本的潜力 RNA 序列正日益被用在多个领域的遗传学研究,并将提供洞察周围细胞功能及发展的许多问题。谢谢观赏 !

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