DNA メチル化解析

Genetics

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Summary

CpG のジヌクレオチドのメチル化は遺伝子発現の調節に重要な役割を果たすと仮定 DNA の化学修飾です。特に、プロモーターと遺伝子の他の規制要素の近くに、「CpG 島」と呼ばれる、メチル化サイトのクラスターのメチル化安定を黙らせる遺伝子、たとえば、遺伝子刷り込みや x 染色体の不活性化などのエピジェネティックな過程に貢献するかもしれない。同時に、CpG メチル化は、がんに関連する示されています。

このビデオでは、生物学的機能および DNA のメチル化のメカニズムと一緒に表示されます、ゲノムのメチル化サイトを識別するために使用される様々 な技術。重亜硫酸塩の分析のステップを順に調べますが、この手法のいくつかのアプリケーションと同様に、DNA のメチル化を検出するため、最もよく使われる方法。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 遺伝学の必需品. DNA メチル化解析. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

DNA のメチル化は、化学修飾 DNA 細胞の異なるコンテキスト下での遺伝子発現に影響を与えるのです。多くの研究者は、DNA メチル化異常はがんなどの病気に関連付けられている、このプロセスのメカニズムなどに興味があります。

このビデオでは、DNA メチル化とそれを検出する方法の背後にある原則をカバーします。その後、これらのメソッド、重亜硫酸塩の分析、および本手法のいくつかのアプリケーションの 1 つのための一般的なプロトコルを探る。

まず、どのような DNA のメチル化は、検知することができる方法を見てみましょう。

この生化学的過程では、セルはその DNA のシトシン塩基のメチル グループとして知られている化学のタグを追加します。同じ DNA の繊維とこれらの隣接したヌクレオチドのグアニン塩基の横に発生するメチル化シトシン最も- とそれらのリンクのリン酸ジエステル結合 —「Cpg。」と呼ばれますほとんどの脊椎動物の Cpg がメチル化され、それらがメチル化 CpG「島」のプロモーター近く積極的に表現される遺伝子および他の各種の規制シーケンス要素の近くに発生する傾向があります。

DNA のメチル化の変化が遺伝子の規則に貢献する方法はまだ強烈な捜査の対象です。CpG アイランドのメチル化はエピジェネティックなプロセス サイレンシングの雌の哺乳類の各セルに 2 つより 1 つの x 染色体の不活性化と同様に、特定の遺伝子の特異的発現、元の親であるゲノムインプリンティングなどに見られる、安定した長期的な遺伝子サイレンシングの重要と思われます。CpG アイランドのメチル化のための重要な遺伝子の抑圧は、がんにつながることができます制御されない細胞増殖に貢献して示されています。機械論的に、DNA のメチル化遺伝子サイレンシングの促進者に関連付けるか防止の転写因子、ヒストンを変更し、改装してクロマチン転写非寛容な状態に蛋白質を募集に貢献するかもしれない。

DNA のメチル化状態を検出するためのいくつかの方法があります。

1 つの方法には、ヘルプの試金には、 HpaII とMspI は、それぞれ切断のみ非メチル化、またはメチル化および非メチル化、CCGG シーケンスと呼ばれる 2 つの制限酵素が含まれます。これらの 2 つの酵素による消化パターンを比較すると、DNA のメチル化の状態を推測することができます。

メチル化 DNA 免疫沈降または"MeDIP"と呼ばれる別の方法では、メチル化された DNA シーケンスを豊かにするメチル化シトシンと結合する抗体を使用します。

最後に、重亜硫酸塩分析を非メチル化シトシンをウラシルに変換する化学反応の遂行によってメチル化 DNA の非メチル化シトシンから区別するために使用します。この変換後 DNA を重亜硫酸塩扱った PCR を受ける、シーケンス、および比較が可能参照ゲノム。非メチル化シトシンは、リファレンスではあるが、次の重亜硫酸塩分析および PCR チミンに置き換えられます。研究者は DNA を重亜硫酸塩扱ったを質量分析にかけること、によって「メチル化エピグラム」直線的ゲノムの異なる Cpg を表すし、それらのそれぞれでメチル化度を表すを作成することも。このようなエピグラム、研究者が異なる種類の細胞のメチル化パターンを比較する場合に特に役立ちます。

重亜硫酸塩の分析のためのプロトコルについて詳しくをみましょう。

まず、水酸化ナトリウムが 95 ° C で孵ったが、ゲノム DNA の準備に追加されます。これは、DNA を変化、拠点を後の化学反応にアクセス可能になります。ピロ亜硫酸ナトリウムを導入して、変性 DNA の混合物に、化学反応の 2 つの手順が発生します。最初のステップ、スルホン、亜硫酸シトシン スルホン酸を形成する非メチル化シトシンにグループを追加します。その後、油圧脱アミノ化中にアミノ グループはウラシルのスルフォン酸塩を生成するシトシンのスルフォン酸塩から削除されます。

これらの最初の段階の化学反応を促進するには、DNA の準備はミネラル オイル、蒸発を防ぎ、ピロ亜硫酸ナトリウムの濃度を維持するのに役立ちます, します。暗闇の中で 55 の ° C で反応をインキュベーションします。この手順では、エージェントなど、キノールの酸化を防ぐためにも混合物に追加されます。

ウラシル スルホン酸・無鉱物油を含んでいる変更された DNA を収集するために混合物は、遠心分離、最下位の液体層が回復しました。このソリューションの DNA は、精製します。

インキュベーションする 37 ° C での DNA の混合物に水酸化ナトリウムを追加する次に、これは、desulfonation を誘発するを-あなたが推測している可能性があります-亜硫酸グループ ウラシル スルホン酸、ウラシルを形成し、化学反応を完了するから削除します。

最後に、混合物は、酢酸アンモニウムの添加で中和され、DNA がエタノールの沈殿物によって収集されます。重亜硫酸塩の変換された DNA が精製されて、一度 PCR とシーケンスを受けた。

今では我々 は重亜硫酸塩分析の基本的なテクニックを議論して、いくつかの実験的アプリケーションを見てみましょう。

一部の研究者は、遺伝子刷り込みを調査するのに重亜硫酸塩分析を使用します。ここでは、研究者を渡ったので母親の遺伝的差異とシロイヌナズナの 2 系統と父方の DNA を区別することができます。メチル化パターン結果胚と関連付けられている胚乳や胚をサポートする組織は、比較しました。このメソッドを使用して、科学者は、組織特異的な刷り込みを示す胚、胚乳、非メチル化にはメチル化に傾向がの蛋白質符号化の遺伝子、 MEA、妊産婦アレルの Cpg を見つけた。

他の研究者はこれを使用しているどのように環境あるいは社会的要因を理解する手法はメチル化パターンを変えることができます。ここでは、マウスの子犬はストレスを誘発するために、母親から分離され、脳の組織はその後分離しました。次のシーケンスの DNA を重亜硫酸塩扱った、科学者決定「分離」子犬の特定の脳領域ではAVP、ホルモン符号化の遺伝子のメチル化パターンが変更されて初期の人生経験の長期的生物学的影響の分子メカニズムを示唆しています。

最後に、多くの研究者はユニークな個々 の細胞間のメチル化パターンの比較を容易にする重亜硫酸塩の分析を最適化しようとしています。ここでは、研究者は、DNA の損失を防ぐを助けたの agarose に埋め込まれた個々 のマウス卵母細胞のすべてのステップを行ったので、重亜硫酸塩の分析法を変更しました。このメソッドを使用して、研究者が、複数のメチル化パターンを与えたものを探して、他の細胞汚染されていた単一卵母細胞サンプルを簡単に識別することができます。

メチル化敏感な分析にゼウスのビデオを見てきただけ。ここでは、我々 は DNA のメチル化は遺伝子発現制御に果たしている役割を説明してきた研究者をゲノム、重亜硫酸塩の分析のための一般化されたプロトコルおよび最後に、この手法のいくつかのアプリケーションでメチル化領域を識別するために使用するメソッド。いつも見てくれてありがとう!

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