重组和基因打靶

Genetics

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Summary

在现代生物学中最广泛使用的工具之一是分子克隆与限制性内切酶,其中创建兼容两端之间允许他们连在一起的 DNA 片段。然而,这种技术有一定限制大型或复杂的 DNA 结构代其适用性的限制。较新的技术,解决一些这些不足之处是重组,修改 DNA 同源重组 (HR),基于绵延的相似或相同序列的不同 DNA 分子之间的交流。基因打靶,以优势的内源性 HR 改变生物体的基因组在特定的基因座,与基于人力资源的克隆技术已大大提高的速度和效果的高通量基因工程。

在这个视频中,我们介绍了人力资源,以及执行重组工程实验,包括重组主管生物和基因组库如细菌人工染色体 (BAC) 所需的基本组件。我们然后走过一种协议,使用重组来生成一个基因打靶的向量,最终可以染胚胎干细胞生成的转基因动物。最后,将提出几个突出的实用程序和各种各样的重组工程技术的应用。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 遗传学精要. 重组和基因打靶. JoVE, Cambridge, MA, (2019).

克隆,同源重组或重组工程,极大地改善进行高通量基因工程研究人员的能力。经典的分子克隆需要消化的向量和插入具有相同的限制酶,来生成兼容两端有"重组",但尤其是当试图孤立地区从较长的序列,如一段基因组 DNA,有并非总是将削减周边地区的利益,并不在该区域内或其它地方在序列中的唯一的限制性内切酶。避免出现这些限制网站的需要,通过重组提供更为高效和具有成本效益的方式,使基因工程构造。

在这个视频中,我们将介绍基因重组的原则,为重组基因靶向性的载体,提供一般的协议和讨论这些技术的若干应用。

首先,让我们讨论一下什么重组是和如何应用它。

遗传重组需要 DNA 分子之间的信息交流。在"同源重组",相对大片的相似或相同的 DNA 序列进行交换。单元格使用此过程来修复双链断裂,和性繁殖的真核生物也进行这之间同源染色体在减数分裂来增加遗传多样性。

同源重组被用于实验的目的,在细胞中包括的特定的内源性基因改性的数目 — — 被称为"基因打靶"。它也适用于工程的基因构造,这个过程被称为"重组,"靶向生物的基因组进行修改 DNA 大片尤其有用。为此,研究人员可以利用"基因库"或向量集的每个包含长基因组 DNA 片段。各种类型的能力不同,通常传播的细菌克隆,图书馆已经问世,并可以责令从商业或非盈利性资料库。最常用类型的基因组文库之一被称为细菌人工染色体或 BAC,可以携带 150-350 kilobases 之间插入大小。

到 recombineer 的构造,科学家需要有机体中的同源重组发生的顺序。酵母酵母是自然"重组-主管"可以随时向量间的同源重组及进行插入。另一个常用应用的系统使用"红色"蛋白质从噬菌体 λ,在细菌大肠杆菌重组。向量可以是 recombineered 在以前建立的红色表示的细菌菌株,或质粒编码红系统组件能够共同转化为重组基质的细菌。

现在,让我们看一下协议创建一个基因打靶载体的重组。

本议定书的目的是创建目标更改特定基因的转基因的老鼠。简单地说,感兴趣的基因所需的修改都是在 BAC;改进的序列"检索"入靶向载体,和此向量胚胎干细胞的基因靶向转染。干细胞可用于生成转基因的动物。这最后的程序的说明,请参阅朱庇特科学教育视频"基因工程的生物模型"。

若要开始,包含感兴趣的基因组序列的 BAC 克隆是确定和命令。接下来,同源性武器或寡核苷酸包含 30-50 完全同源区域,设计。这些寡核苷酸作为引物 PCR 反应用于生成 DNA 用于修改感兴趣的基因的"录像带"。这些录音带通常包含,例如,可以作为选择标记,可以从许多公开可用的质粒容易放大的抗生素抗性基因。BAC 细菌克隆然后转化,例如通过电穿孔,携带质粒编码红系统组件,其次是同源臂含录音带。在适当的温度,诱导重组然后孵化的细菌。

要从 BAC 恢复修改的序列,"检索"向量线性和放大使用引物包含涵盖几个 kilobases 修改地点周围的同源性武器。此向量骨干变成了 BAC 的细菌克隆,和重组再一次引起。矢量通过从 BAC"检索"适当的序列将"差距修复"。这会导致修改的利息,以及到周边的修改的序列的基因组 DNA 同源性的区域顺序基因打靶载体。此向量然后被纯化、 线性化和引入地方内源性同源重组机械将目标修改的序列到相应的轨迹,从而改变宿主基因组的胚胎干细胞。

现在让我们看看基于重组工程技术的一些应用。

首先,研究人员可以使用重组,快速、 轻松地工程师将细菌的基因组,例如,要研究蛋白质复合体。在这里,编码序列的多肽亲和标记以及卡那霉素抗性选择标记卡带被设计为 recombineered 3、 的末日到了感兴趣的基因。此向量然后引入红"重组主管"大肠杆菌,并成功重组体的分离采用选择性培养基。标记的蛋白质复合物进行生化纯化利用蛋白质,强烈绑定到的标记,并分析了质谱确定感兴趣的蛋白质相互作用伙伴。

重组和基因打靶也可以用来修改的寄生生物,如细胞内寄生虫弓形虫,导致弓形虫病基因组。在此研究中,靶向载体是 recombineered 在酵母,侧翼感兴趣的基因的基因组序列被放置在选择标记。矢量然后进行线性化和转到寄生虫。有限稀释电镀用选择性培养基,用于分离成功重组,其中寄生虫的同源重组机械替换工程序列,因而删去感兴趣的基因的基因组序列。聚合酶链反应的靶区证实积极重组事件。

最后,称为加插入或 SPI,亚克隆,已制订了些了哪些差距修复和盒式磁带插入过程同时发生,使重组过程更简单、 更灵活。这一进程成功的关键是正确设计的多个同源性武器,其中,在达 180 bp,长于常规重组提高重组效率。后将纳入亚克隆质粒和插入卡带 pcr 的同源性武器,他们在一起变成了红色表示 BAC 克隆和重组诱导。成功 recombineered 构造然后进行定性 PCR 或限制摘要分析。

你刚看了关于重组的朱庇特的视频。在这个视频中,我们已经讨论了重组和如何使用它们可以在基因工程中,提供重组工程项目和这些技术的最后几个应用程序的协议的原则。一如既往,感谢您收看 !

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