Overview
Eines der am häufigsten verwendeten Werkzeuge der modernen Biologie ist molekulare Klonierung mit Restriktionsenzymen, die kompatibel enden zwischen DNA-Fragmente zu schaffen, die ihnen ermöglichen, miteinander verbunden werden. Diese Technik hat jedoch bestimmte Einschränkungen, die seine Eignung für große oder komplexe DNA-Konstrukt-Generation zu begrenzen. Eine neuere Technik, die einige dieser Mängel Adressen ist Restriktionsenzymen, die DNA mit Hilfe homologe Rekombination (HR), den Austausch zwischen unterschiedlichen DNA-Molekülen basierend auf erstreckt sich von ähnlichen oder identischen Sequenzen modifiziert. Zusammen mit Gene targeting-, die endogene HR Genom eines Organismus an einem bestimmten Loci verändern nutzt, haben HR-basierte Klonierungstechniken erheblich verbessert die Geschwindigkeit und Wirksamkeit von Hochdurchsatz-Gentechnik.
In diesem Video stellen wir die Grundsätze des HR, sowie die grundlegenden Komponenten erforderlich, um ein Experiment von Restriktionsenzymen, einschließlich der Rekombination zuständigen Organismen und genomische Bibliotheken wie bakterielle künstliche Chromosomen (BAC) durchführen. Dann gehen wir durch ein Protokoll, die Restriktionsenzymen verwendet, um einen gen-targeting Vektor zu generieren, der letztlich an embryonalen Stammzellen ein transgenen Tieres generieren transfiziert werden können. Schließlich werden einige Anwendungen, die den nutzen und die Vielzahl von Restriktionsenzymen Techniken markieren vorgestellt.
Procedure
Klonen durch homologe Rekombination oder Restriktionsenzymen, hat die Forscher die Fähigkeit zur Durchführung von Hochdurchsatz-Gentechnik stark verbessert. Klassischen molekularen Klonen erfordert Verdauung von Vektoren und fügt mit der selben Restriktionsenzymen kompatibel enden für "Rekombination" zu generieren, aber vor allem, wenn Sie versuchen, eine Region von einer längeren Sequenz, wie z. B. eine Strecke von genomischer DNA isolieren gibt es nicht immer Restriktionsenzyme, die einzigartig in der Region von Interesse, und nicht innerhalb der Region oder an anderer Stelle in der Sequenz geschnitten wird. Durch Vermeidung der Notwendigkeit dieser Restriktionsschnittstellen, bietet Restriktionsenzymen einen wesentlich effizienteren und kostengünstigen Weg, um Gentechnik-Konstrukte zu machen.
In diesem Video werden wir die Grundsätze der genetischen Rekombination, vorsehen einem allgemeinen Protokolls Restriktionsenzymen Gene-targeting Vektor, und mehrere Anwendungen dieser Technologien zu diskutieren.
Zuerst lassen Sie uns besprechen, welche Rekombination ist und wie es angewendet werden kann.
Genetische Rekombination beinhaltet den Austausch von Informationen zwischen den DNA-Moleküle. In "homologe Rekombination," sind relativ weite Teile von ähnlichen oder identischen DNA-Sequenzen ausgetauscht. Zellen verwenden Sie diesen Prozess, um doppelte Strangbrüchen zu reparieren, und sexuell reproduzierende Eukaryoten auch dies zwischen Homologen Chromosomen während der Meiose genetischen Vielfalt zu erhöhen.
Homologe Rekombination hat für eine Reihe von experimentellen Zwecken, einschließlich der Änderung von bestimmten endogenen Loci in Zellen genutzt wurde – genannt "Gene targeting." Sie gilt auch für das Engineering von genetischen Konstrukte, einen Prozess namens "Restriktionsenzymen", was besonders nützlich für Änderungen an weite Teile der DNA für die Zielgruppenadressierung auf Genom eines Organismus ist. Um dies zu tun, Forscher nutzen "genomische Bibliotheken" oder Gruppen von Vektoren jedes enthaltenden lange genomischen DNA Fragmente. Verschiedene Arten von Bibliotheken mit unterschiedlichen Kapazitäten, in der Regel in bakteriellen Klone propagiert wurden erstellt und können aus kommerziellen oder Non-Profit-Repositories bestellt werden. Eines der am häufigsten verwendeten Arten von genomic Bibliothek nennt man eine bakterielle künstliches Chromosom oder BAC, die eine Plattengröße zwischen 150-350 Kilobases tragen kann.
Um zu Recombineer ein Konstrukt Wissenschaftler Bedarf ein Organismus in die homologe Rekombination auftritt. Die Hefe Saccharomyces Cerevisiae ist natürlich "Rekombination-kompetent" und kann ohne weiteres durchführen homologe Rekombination zwischen Vektor und einfügen. Eine weitere häufig angewandte System nutzt die "Roten" Proteine von Bakteriophagen Lambda, die in das Bakterium E. Coliwiederhergestellt ist. Vektoren können sein Recombineered in vorher festgelegten rot exprimierenden Bakterienstämme, oder ein Plasmid-Codierung, die roten Systemkomponenten mit Restriktionsenzymen Substrate in die Bakterien Co umgewandelt werden können.
Nun, gehen wir durch ein Protokoll zum Gene-targeting Vektor von Restriktionsenzymen erstellen.
Das Ziel dieses Protokolls ist die Schaffung eine gentechnisch veränderte Maus mit gezielte Änderungen an ein bestimmtes Gen. Gewünschte Änderungen an das gen des Interesses sind kurz, in eine BAC gemacht; die geänderte Reihenfolge wird in einem Targetingvektor "abgerufen", und dieser Vektor ist an embryonalen Stammzellen für die Ausrichtung gen transfiziert. Die Stammzellen können dann verwendet werden, um das gentechnisch veränderte Tier zu generieren. Anweisungen zu diesem letzten Verfahren, entnehmen Sie bitte der Wissenschaftsbildung JoVE video "Genetic Engineering von Modellorganismen."
Um zu beginnen, ist ein BAC-Klon mit der genomischen Sequenz von Interesse identifiziert und bestellt. Als nächstes sind die Homologie Arme oder Oligonukleotide mit 30-50 Länge homologen Regionen ausgelegt. Diese Oligonukleotide dienen als Grundierungen in PCR-Reaktionen, um die DNA "Kassetten" verwendet, um das gen des Interesses ändern zu generieren. Diese Kassetten enthalten in der Regel, zum Beispiel Antibiotika-Resistenz-Gene, die als Selektionsmarker, wirken können, die von vielen öffentlich zugänglichen Plasmide leicht verstärkt werden kann. Der BAC bakterielle Klon wird zum Beispiel durch Elektroporation, dann mit einem Plasmid Codierung der roten Systemkomponenten, gefolgt von der Homologie Arm-haltigen Kassetten umgewandelt. Die Bakterien werden dann bei der entsprechenden Temperatur induzieren Rekombination inkubiert.
Um die geänderte Reihenfolge der BAC beheben, ein "Retrieval" Vektor wird linearisiert und verstärkt mit Primer mit Homologie Waffen, die mehrere Kilobases rund um den Ort der Veränderung zu decken. Dieser Vektor Rückgrat verwandelt sich in die bakterielle BAC-Klon, und Restriktionsenzymen wieder induziert wird. Der Vektor werden "Lücke-repariert", indem Sie die entsprechende Sequenz aus der BAC "abrufen". Dies führt zu einer gen-targeting Vektor enthält die geänderte Reihenfolge der Interesse sowie Regionen, die homolog zu genomischer DNA, die rund um die veränderte Reihenfolge sind. Dieser Vektor kann dann gereinigt, linearisiert und an embryonalen Stammzellen, wo die endogenen homologe Rekombination Maschinen die veränderte Sequenz, die die entsprechenden Locus, damit eine Veränderung das Wirtsgenom Ziel wird, eingeführt.
Schauen wir uns nun einige Anwendungen der Rekombination basierende engineering-Techniken an.
Erstens können die Forscher Restriktionsenzymen verwenden, um schnell und einfach das bakterielle Genom, z.B. Ingenieur, Proteinkomplexe zu studieren. Hier wurde eine Kassette, die Codierung eines sequentiellen Peptid Affinität-Tags sowie eine Kanamycin-Resistenz-Selektionsmarker entwickelt, um Recombineered in 3 ¢ Ende des Gens von Interesse sein. Dieser Vektor wurde dann in rot "Rekombination-kompetente" E. Colieingeführt und erfolgreich Recombinants wurden mithilfe von Selektivmedien isoliert. Tagged Proteinkomplexe wurden biochemisch gereinigt mit Proteinen, die stark an die Tags binden und analysiert durch Massenspektrometrie, die Interaktionspartner des Proteins des Interesses zu identifizieren.
Restriktionsenzymen und Gene targeting können auch verwendet werden, um das Genom des parasitären Organismen, wie z. B. die obligat intrazelluläre Parasiten Toxoplasma Gondii, ändern, wodurch die Krankheit Toxoplasmose. In dieser Studie wurde ein Targetingvektor Recombineered in Hefe Genomsequenzen flankieren das gen des Interesses um ein Selektionsmarker platziert wurden. Der Vektor wurde dann linearisiert und elektroporiert in der Parasiten. Begrenzung der Verdünnung Beschichtung in Selektivmedien wurde verwendet, um erfolgreiche Recombinants zu isolieren, in denen der Parasit homologe Rekombination Maschinen mit veränderter Reihenfolge, so löschen das gen des Interesses die genomische Sequenz ersetzt. PCR der gezielten Region bestätigt positive Rekombinationsereignisse.
Zu guter Letzt ein Verfahren bekannt als subcloning plus einfügen oder SPI, in welche Lücke Reparatur- und Kassette einlegen entwickelt worden gleichzeitig auftreten, Restriktionsenzymen Entscheidungsprozess, einfacher und flexibler. Entscheidend für den Erfolg dieses Prozesses ist die richtige Gestaltung von mehreren Homologie Waffen, die bei bis zu 180 bp, sind länger als bei herkömmlichen Restriktionsenzymen um Rekombination Effizienz zu erhöhen. Nach Einbeziehung der Homologie Arme in die subcloning Plasmid und Einfügung Kassetten durch PCR, sie waren zusammen in einen roten exprimierenden BAC-Klon verwandelt und Restriktionsenzymen induziert wurde. Recombineered Konstrukte wurden erfolgreich dann durch PCR oder Einschränkung Digest-Analyse identifiziert.
Sie haben nur Jupiters Video auf Restriktionsenzymen angesehen. In diesem Video haben wir diskutiert, die Grundsätze der Rekombination und wie sie in der Gentechnik, ein Protokoll für ein Projekt von Restriktionsenzymen und schließlich mehrere Anwendungen dieser Techniken verwendet werden können. Wie immer vielen Dank für das ansehen!
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