基因组编辑

Genetics

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Summary

行之有效的方法,用于修改特定序列在基因组中的基因打靶同源重组,但这种方法可以是费力和仅适用于某些有机体。最近的发展对"基因组编辑"的发展,通过诱导双链的作品打破了 DNA 使用工程引导目标基因地点由蛋白质或 Rna 识别特定序列的核酸酶酶。突变细胞试图修复这一损坏,可以引入有针对性的 DNA 区域。

在这个视频中,朱庇特解释基因组编辑,背后的原则强调如何这种技术涉及 DNA 修复机制。然后,三个主要的基因组编辑方法 — — 锌指核酸酶、 人才和 CRISPR Cas9 系统 — — 评述,其次是协议为使用 CRISPR 创建有针对性的在哺乳动物细胞中的遗传变化。最后,我们讨论了目前某些应用基因组编辑来改变模型的有机体或细胞的基因材料的研究。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 遗传学精要. 基因组编辑. JoVE, Cambridge, MA, (2019).

基因组编辑包括的技术,研究人员可以"编辑"或更改一个特定的 DNA 序列。这些方法依赖于小"裁员"的 DNA,细胞尝试修复,往往未完全建立。以这种方式,科学家们可以与更高的效率,相对于经典的基因靶向诱导目标序列突变。

在这个视频中,我们会检讨三种基因组的编辑技巧,背后的原则,并为其中之一,CRISPR Cas9 系统讨论广义的议定书。然后,我们将探讨这些方法的一些应用。

首先,让我们看看背后基因组编辑的原则。

引入特定序列在基因组的遗传变化的典型方法是基因打靶同源重组,哪里的同源序列成靶向建设纳入导致"出开关"的内源性基因的改动的版本。

像基因打靶技术,基因组编辑可以针对特定 DNA 区域,更改,但可以做到与更高的效率,建立更多的细胞所需的突变在任何给定的实验。

所有基因组编辑方法依赖细胞的能力,来修复由核酸内切酶对其 DNA 双链断裂。这种损害可能修复通过同源末端连接或 NHEJ,在哪里断了 DNA 封装,直接;或由同源性指导修复或 HDR,损害由从同源模板复制。NHEJ 通常是完美的并不能导致被删除或添加到修复的 DNA,因此变异目标序列的几个基地。另一方面,HDR 允许研究人员能够直接对目标站点的特定更改模板中添加。

三种主要基因组编辑技术开发和推广近几年。

在一个方法中,研究者保险丝 DNA 结合"锌指"域的某些转录因子到DNA 裂解域我核酸内切酶。正如每个锌手指域认识到一个特定的核苷酸三胞胎,这些域可以人工链接在一起到工程师锌指核酸酶或制做,独特的 DNA 序列为目标。

同样,核酸酶称为"人才"联接霍英东于变量的 DNA 结合域的细菌蛋白质称为转录活化剂样效应器或故事。每个故事域确认单、 独特的 DNA 碱基,给人才他们序列特异性。

最后,CRISPR Cas9 系统使用原核生物的免疫系统,通常由外国的遗传材料,类似于病毒或质粒中保护其反对入侵的主机的组件。在这个系统中的入侵被称为"protospacers"的外源 DNA 片断都纳入 CRISPR 位点,这是然后转录和蛋白质-RNA 机械成叫做 crRNAs 的小分子 Rna 由处理。

科学家正在利用基因组编辑用于 CRISPR 机械通过设计类似 crRNA 的指南序列被称为"单指南"或 sgRNA,可用于几乎任何所需的基因序列,在哺乳动物细胞中或感兴趣的其他系统到目标 Cas9。简单的可定制性的 RNA 序列基于 CRISPR Cas9 系统提供超过基于蛋白质的基因组编辑方法制做和人才等明显的优势。

现在,您已经了解基因组编辑背后的原则,让我们回顾使用 CRISPR 在哺乳动物细胞中创建有针对性的遗传变化的典型协议。

首先,选择了一个基因组的位置来对其进行编辑。这一地区必须很短 — — 约 20 个碱基对的大小 — — 和拥有 3 完全长"protospacer 相邻主题"或"PAM"在它的 3 ′ 末端。PAM 是需要 Cas9 承认并忠于目标 DNA 区域,和准确的顺序是特定于有机体--原产地的 Cas9 正在使用。一旦确认了一个潜在的站点,它应该被搜寻反对要确保类似的网站都找不到其他地方在基因组中,并因此将编辑没有偏离目标的基因组区域的基因组序列。

合成 CRISPR 指导序列,生成两个寡核苷酸,一个相同和一对目标序列的补充。额外的序列被列入他们的 5 ′ 末端 sgRNA 向量与兼容性。这些寡核苷酸是然后混合在一起,变性,,然后退火。

下一步,质粒 sgRNA"脚手架"是用适当的限制酶切,合成 CRISPR 指导序列,混合,用连接酶酶来创建 sgRNA 建设孵化。然后可以变成细菌和培养扩增质粒。一旦细菌分离提纯,CRISPR 构造是共转染,用构造编码 Cas9 到其基因组是要编辑的单元格。这些基因转染的细胞被培养以形成克隆的殖民地。

基因组 DNA 可以从每个殖民地分离和分析应用 PCR 和测序到屏幕为那些 CRISPR 系统已产生所需的突变。

现在让我们看看科学家们正在利用基因组编辑技术的某些方面。

许多研究者使用编辑记者序列引入特异位点的基因组。在这个实验中,制做了用于将绿色荧光蛋白插入参与神经元发展和生存的基因。研究人员证实他们正确的目标这种基因指导干细胞分化为神经元,和执行免疫荧光双标记为绿色荧光蛋白和神经元的标记。

基因组编辑也使得它更容易产生"淘汰赛"有机体的感兴趣的基因呈现非功能性。在这里,研究者试图通过基因敲除小鼠胚胎注射 mRNA 编码目标特异性基因的人才。随后核酸内切酶处理的 DNA 从塔伦治疗小鼠使研究人员能够识别动物的两个副本中的靶向性基因的突变。

最后,基因组编辑可以用于创建大型基因缺失造成两双链断裂在同一染色体区域。当基因或遗传因素的作用不能淘汰的创建与编辑协议的传统基因组小缺失时,可能需要这些大的缺失。在这里,与绿色荧光蛋白的研究人员 co 植物鼠标癌症细胞构造和两个 CRISPR 构造内驾驶癌症基因靶向不同领域。细胞,成功转染,因而会发出绿色荧光蛋白信号,分离荧光激活细胞分选,和随后的 PCR 和测序鉴定的细胞 DNA 区域两个 CRISPR 目标站点之间已被删除。

你刚看了基因组编辑朱庇特的视频。在这里,我们已经回顾了制做,人才,背后的原则和 CRISPR,探索一个一般的 CRISPR Cas9 协议,并讨论了研究人员如何使用基因组今天编辑技巧。一如既往,感谢您收看 !

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