Overview
Source : Laboratoire de Dr. Ana J. García-Sáez — Université de Tübingen
La plupart des échantillons d’intérêt sont des mélanges de plusieurs composants différents. Préparation de l’échantillon, une étape clé dans le processus analytique, supprime les interférences susceptibles d’influer sur l’analyse. Par conséquent, développer des techniques de séparation est un effort important non seulement dans les milieux universitaires, mais aussi dans l’industrie.
Une façon de séparer les mélanges est d’utiliser leurs propriétés de solubilité. Dans ce court document, nous allons traiter des solutions aqueuses. (1) concentration ionique de la solution, le pH (2) et (3) lorsque la température dépend de la solubilité d’un composé d’intérêt. En manipulant avec ces trois facteurs, une condition dans laquelle le composé est insoluble peut servir à supprimer le composé d’intérêt du reste de l’échantillon. 1
Principles
Un certain nombre de paramètres peut servir à séparer un échantillon intéressant des impuretés en réduisant sa solubilité et désolidarisé de la solution sous forme de solide, tel qu’illustré à la Figure 1. Tout d’abord, la force ionique de la solution peut changer une solubilité de substances. Cela implique souvent l’ajout de sel supplémentaire (également appelé relargage), ou l’ajout d’une contre-ion, qui forme une espèce moins soluble avec le composé d’intérêt. 2
Figure 1. Les équilibres de solubilité sont affectés par la concentration ionique, le pH et la température. Un composé d’intérêt (jaune) est séparé des impuretés (rouges) en changeant sa solubilité dans un solvant donné.
Le pH d’une solution peut changer la charge nette du composé. À un certain pH, la charge nette devient nulle (également appelé point isoélectrique) et le composé devient moins soluble dans l’eau, finissent par former un solide. La température affecte aussi solubilité, tel qu’une température plus élevée augmente la solubilité des solides.
Le taux de formation solide détermine la pureté relative (Figure 2). En général, le terme précipitation désigne la formation d’un solide à un rythme rapide, produisant ainsi un échantillon amorphe avec certaines impuretés piégés au sein. Ceci est fréquent dans le salage et processus dues aux changements de pH. Quand ce processus est ralenti, les impuretés ne sont pas pris au piège dans l’enceinte et un solide relativement pur est produit. Cette technique est employée dans la recristallisation. Dans ce processus, un composé est dissous dans assez solvant afin d’être juste à son point de saturation à une température élevée. Cela saturé solution est ensuite laisser refroidir lentement. Lorsque la solution refroidit, diminue la solubilité du composant, et le composé excédant la solubilité forme un solide bien ordonné (autrement connu sous forme de cristaux) au lieu d’un solide amorphe. Impuretés dans la solution de ne pas obtenir coincées comme la lenteur du processus permet l’élimination de ces impuretés à la surface du solide avant qu’ils sont pris au piège. 1
La figure 2. Différence entre les précipitations et la recristallisation.
Une fois que le solide a formé (comme un cristal ou un précipité), il doit être séparé du reste du mélange. Filtration est un moyen de les séparer. Ceci emploie un matériau poreux qui inhibe sélectivement le passage de la matière solide, mais pas la solution.
Centrifugation est une autre façon de séparer le précipité du reste du mélange. Centrifugation utilise l’accélération centripète pour séparer les mélanges basés sur leur densité. Depuis le solide est plus dense que la solution aqueuse, les sédiments solides au fond du récipient. Le solide est aussi appelé le culot et la solution aqueuse, le surnageant. Le surnageant peut ensuite être décanté ou extraites à l’aide d’une pipette ou une seringue. Les cristaux sont fragiles et centrifugation n’est souvent pas employée pour les séparer de la solution.
Cette vidéo couvre différentes méthodes de séparation de composés à travers la solide formation (salage, changements de pH et recristallisation) et leur retrait subséquent de la solution aqueuse par filtration ou centrifugation.
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Procedure
1. la précipitation de CaCO3
- Préparer 5 mL de 1 M CaCl2.
- Préparer 5 mL 1 M Na2CO3.
- Dans un tube à centrifuger petit (1,5 mL), ajouter 750 µL de CaCl2 et 750 µL de Na2CO3.
- Attendre 2 min pour la réaction de se produire. La solution devrait tourner nuageuse.
- Centrifuger le mélange à 10 000 × g pendant 5 min.
- Décanter le liquide surnageant.
- Ajouter 1 mL d’eau froide dans le culot.
- Resuspendre le culot en mélangeant dans un vortex pour 10 s.
- Centrifuger le mélange à 10 000 × g pendant 5 min.
- Décanter le liquide surnageant.
2. la précipitation des protéines du lait
- Versez le lait dans un bol et ajouter un.
- Lait chaud doucement jusqu'à 40 ° C dans une plaque de cuisson en remuant. Ne pas chauffer à plus de 40 ° C.
- Préparer un 15 % (v/v) d’acide acétique en mélangeant 7,5 mL d’acide acétique et diluer dans l’eau jusqu’à 50 mL.
- Plonger l’électrode d’un pH-mètre dans le lait tiède et surveiller le pH.
- Ajoutez l’acide acétique goutte-à-goutte au lait jusqu'à atteindre un pH de 4,6.
- Filtration du lait
- Flûte d’un morceau de papier filtre et le placer dans un entonnoir.
- Placez l’entonnoir dans une fiole et verser la solution de lait acidifié dans l’entonnoir.
- Que la solution est versée, le papier filtre peut s’obstruer. À l’aide d’un agitateur, agiter la solution et le papier filtre occasionnellement pour déboucher. Si elle n’améliore pas le passage de la solution, changer le filtre en papier.
- Placer un nouveau filtre en papier sur la paillasse et le transfert tout autant de l’humide solide pour le nouveau filtre en papier. Cela devrait absorber plus d’eau du solide.
- Si le nouveau filtre en papier est trop mouillé, continuer à le modifier jusqu'à ce qu’il y a peu d’humidité sur le papier filtre. Appuyez légèrement pour absorber plus d’eau si nécessaire.
- Prendre le solide séché et remettre en suspension dans environ 70 % éthanol. Filtrer le solide à la suite de mesures 2.6.1 à 2.6.5.
- Centrifugation du lait (comme alternative à la filtration)
- Transférer des portions de 50 mL du mélange de tubes à centrifuger de 50 mL.
- Centrifuger à 4 500 × g pendant 10 min, puis décanter le liquide surnageant.
- Ajouter 50 mL d’éthanol à 70 % au culot.
- À l’aide d’un agitateur, resuspendre le culot dans l’éthanol.
- Centrifuger cette suspension après étape 2.7.2.
- Resuspendre le culot dans un tampon pour approfondir l’analyse comme le SDS-PAGE, sinon conserver à 4 ° C.
3. la recristallisation de KCl
- Peser 50 g de KCl dans un erlenmeyer et ajouter 100 mL d’eau
- Faire chauffer le mélange jusqu'à ce que l’eau bout. Veillez à ce que toute la poudre KCl est dissoute. Certaines impuretés ne peuvent pas dissoudre dans l’eau.
- Faire chauffer une autre fiole d’Erlenmeyer (vide) avec le mélange et gardez-le très chaud.
- Placez un entonnoir avec filtre en papier dans le ballon chaud, vide.
- Versez la solution sur le papier filtre pour éliminer les impuretés non dissoutes. Le ballon récepteur est gardé au chaud pour vous assurer qu'aucun changement de température se produire pendant la filtration, sinon qu'un précipité brut formera. Le cas échéant, réchauffez le mélange jusqu'à ce que tous le précipité se dissout.
- Enlever le ballon avec la solution de la chaleur.
- Gardez-le dans un endroit frais dans la chambre et laissez-le refroidir lentement pendant environ 30 minutes, ou jusqu'à ce qu’il n’est donc plus chaud au toucher.
- Une fois refroidi à la température de la pièce, placer le ballon dans un bain de glace pour réduire la température. Alternativement, on peut laisser le ballon à l’intérieur du réfrigérateur ou une salle de contrôle de la température à 4 ° C.
- Cristaux peut être récoltées par filtrage tout comme aux étapes 3,4 – 3,5 (utilisez une fiole et entonnoir à température ambiante).
Précipitation est une technique utilisée pour séparer un mélange issu de la solubilité de ses composants. La solubilité d’un composé dépend de la force ionique de la solution, son pH et de température. Manipulation de ces facteurs peut causer un composé devenir un solide insoluble et tomber de la solution. C’est ce qu’on appelle des précipitations.
L’insoluble solid, appelé le précipité,, au départ constitue une suspension, ce qui signifie qu’il est bien dispersé en solution. Le précipité en général s’agglomère et puis on sépare le liquide par décantation, la centrifugation et la filtration. Cette vidéo présentera plusieurs méthodes de séparation de composés à l’aide de précipitations et démontrer une procédure dans le laboratoire.
Un composé dissous peut être précipité hors de la solution en introduisant une contre-ion. Par exemple, l’argent peut être précipité hors de la solution dans la réaction entre le chlorure de sodium et de nitrate d’argent. L’ion nitrate est remplacée par une contre-ion, chlorure, entraînant la formation de chlorure d’argent massif.
Augmentant la concentration d’une solution de sel peut également induire des précipitations. Cette technique, appelée relargage, est commune pour l’isolement des protéines. À forte concentration saline, les molécules d’eau sont plus attirés par le sel dissous, laissant moins pour stabiliser la protéine. En conséquence, les molécules de protéine agrègent et forment un solide.
Précipitations peuvent aussi être causée par un changement de pH. À pH élevé et faible, la protéine est chargée et attirés par la solution polaire. À un certain moment, la charge nette d’un composé devient nulle. C’est le point isoélectrique, ou pI. Le composé ne peut pas interagir avec la solution polaire, amenant à agréger et précipiter.
La température affecte aussi solubilité, tel qu’une température plus élevée augmente la solubilité des solides. En diminuant la température, les composés dissous peuvent re-solidifier. Le taux de formation solide détermine la pureté relative.
Les expériences suivantes démontreront la précipitation de la caséine, protéine du lait à l’aide de pH et plus loin la séparation grâce à des méthodes de filtration et de la centrifugation.
Pour commencer cette procédure, ajoutez 250 mL de lait dans un bécher avec une barre de remuer. Doucement chauffer le lait à 40 ° C sur une plaque de cuisson en remuant. Plonger un pH-mètre dans le lait tiède et surveiller le pH. Ajouter goutte-à-goutte d’acide acétique dans le lait jusqu'à ce que le pH atteigne le point isoélectrique des caséines, 4.6. Les protéines insolubles de lait ou lait caillé, précipite hors de la solution au point isoélectrique. Retirer le caillé de solution par filtration. Si le papier filtre du colmatage, mélanger avec une spatule pour aider à la solution traversent. Si cela n’améliore pas la filtration, changer le filtre en papier. Transférez le solide mouillé le papier filtre colmaté à nouveau filtre en papier. Cela devrait absorber plus de liquide, ou lactosérum, du solide. Continuer de changer le filtre en papier jusqu'à ce qu’il y a une humidité minimale. En appuyant légèrement sur les solides peut aider le filtre en papier pour absorber plus de petit-lait.
Remettre en suspension les matières solides de lait en poudre dans l’éthanol à 70 % pour laver les phospholipides hors le caillé puis répétez le procédé de filtration. Comme alternative à la filtration, solides de protéines peuvent également être séparées par centrifugation. Centrifuger les portions de 50 mL du mélange lait et éliminer le surnageant. Resuspendre le culot dans 50 mL d’éthanol à 70 % pour enlever les phospholipides du caillé et répétez le processus de centrifugation.
Les solides de protéine de lait peuvent ensuite être stockés ou remis en suspension dans une autre solution pour une analyse ultérieure, comme le SDS-PAGE. Pour plus d’informations, voir notre vidéo sur cette technique. SDS-PAGE analyse montre que précipitation a permis l’élimination des impuretés de la plupart de la whey. Tout la caséine a été trouvé dans le culot, même si aucun ne figurait pas dans le surnageant.
Précipitation est une technique couramment utilisée, qui peut être appliquée pour séparer une variété de mélanges ou solutions.
Composés peuvent être précipités à partir d’une solution à l’aide d’une contre-ion, comme dans cet exemple de la précipitation du carbonate de calcium.
Chlorure de calcium et de carbonate de sodium sont à la fois solubles dans la phase aqueuse.
Quand ils sont mélangés, le calcium et le carbonate forment un solide insoluble, qui peut être séparé par centrifugation. Pour plus d’informations sur ce sujet, visionnage de nos vidéos de formation sur les règles de solubilité.
Précipitations peuvent être utilisées dans la préparation des solides l’échelle du nanomètre qui se trouvent dans un large éventail d’applications en nanotechnologie. Dans cet exemple, les graines de nano-échelle ont été utilisées pour contrôler la croissance de nano-cristaux.
Les précurseurs ont été chauffés, réagit avec séléniure de TRIOCTYLPHOSPHINIQUE et puis rapidement refroidis. Méthanol a été ajouté à la solution refroidie, pour précipiter les solides. Les cristaux ont été ensuite récupérés par centrifugation, et a analysé la structure cristalline par Diffraction des rayons x.
Précipitations permet également à la préparation des ligands polymères pour les applications de livraison de drogue. Dans cet exemple, un ligand est synthétisé et conjugué à la platine comme un traitement anticancéreux. Tout d’abord, le ligand a été synthétisé à l’aide d’un amide, réaction de couplage. Il a précipité au fur de la réaction. Il a été ensuite récupéré à l’aide de filtration.
Le solide a été puis purifiée à l’aide de recristallisation et filtré à nouveau. Le ligand est ensuite complexé avec les composés de platine, séchée et ensuite purifié à l’aide de précipitation fractionnée de l’eau avec de l’acétone. Couplage de platine a été confirmée en utilisant la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire. Les composés pourraient alors être étudiées pour leur efficacité et les effets secondaires comme agents anticancéreux.
Vous avez juste regardé introduction de Jupiter à la séparation d’un mélange à l’aide de précipitations. Vous devez maintenant comprendre les diverses méthodes de précipitation et comment effectuer ces expériences en laboratoire.
Merci de regarder !
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Results
Les équilibres de solubilité est employé dans de nombreux procédés de purification. Calcium peut être retiré de l’eau à l’aide de carbonate de sodium. Le produit de solubilité (Ksp) de CaCO3 est 4,8 × 10-9. Mélanger 1 CaCl2 et 1 M Na2CO3 produit CaCO3 précipité. Le précipité est séparé du reste de la solution en utilisant la centrifugation.
Caséine (une protéine clé dans le lait) a un point isoélectrique à pH 4,6 et formée insoluble caillé à ce pH. Le caillé ont ensuite été séparé du reste de la solution (également appelé lactosérum) à l’aide de filtration ou centrifugation (Figure 3 a). Le caillé a été lavé avec de l’éthanol pour éliminer des phospholipides et autres composés solubles dans l’eau qui ont été également pris au piège dans le caillé. Centrifugation a empêché la perte des protéines mieux que la filtration car il y ont quelques protéines qui collée sur le papier filtre. Les composants sont séparés ont été analysés par SDS-PAGE (Figure 3 b), montrant que la réaction de précipitation séparé la plupart de la caséine de lactosérum. Autres protéines du lait, tels que les globulines, précipitent ainsi que de la caséine. D’autres mesures peuvent être appliquées pour l’isolement des caséines du reste des protéines.
Précipitations élimine les impuretés plus de solide, mais il peut aussi intercepter certaines impuretés dans la matrice. Recristallisation est souvent employée pour purifier davantage un solide (Figure 4). Dans cette expérience, le solide a été mélangé avec un solvant dans lequel le solide n’est pas très soluble. La température du mélange puis accéda au point d’ébullition du solvant et assez solide est ajouté pour saturer le solvant à chaud. Autres impuretés insolubles pourraient alors être retirées via une étape de filtration. La solution d’eau chaude a été ensuite progressivement refroidie à température ambiante et refroidie dans un bain de chambre/glace réfrigérateur/froid. La lenteur du processus a abouti en cristaux au lieu de précipité amorphe. Les impuretés solubles ne sont pas incorporées dans le réseau cristallin et les cristaux qui en résultent sont relativement plus pur que le précipité brut. Les cristaux ont été récoltés puis à l’aide de filtration et la gauche à sécher à l’air (ou dans le vide).
Figure 3. Précipitation des protéines du lait. (A) photos des différentes étapes dans l’isolement de protéine de lait. SDS-PAGE (B) des échantillons différents.
La figure 4. Recristallisation de KCl.
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Applications and Summary
Les réactions de précipitation sont appliquées à nombreux processus de préparation d’échantillon. Comme mentionné précédemment, ils peuvent servir à enlever les ions spécifiques selon leurs équilibres de solubilité ou sels. Ils peuvent également servir pour retirer des mélanges de protéines et autres biomolécules.
Recristallisation est souvent employée pour purifier les plus solides. Ce processus élimine les impuretés piégées dans le solide. Entre autres, la recristallisation peut être utilisée pour purifier les sels et les molécules organiques.
Les techniques de centrifugation et la filtration sont applicables à la plupart des demandes préparation d’échantillon pour séparer les composants insolubles du solvant. Filtration est souvent utilisée en chimie organique pour séparer des composés cristallisés purs de son solvant. Elle est également utilisée après extraction solide-liquide dans la chimie des produits naturels ou de la chimie analytique. Centrifugation est souvent utilisée pour séparer les mélanges de différentes densités et indiquées ici appliqué à la séparation des composants du lait et du sel précipité.
En biochimie, la plupart des processus tels que les protéines, lipides et isolement d’ADN implique des réactions de précipitation, méthodes de centrifugation et la filtration pour purifier les échantillons. Et même si la plupart de ces processus ont été entièrement normalisée dans les kits commerciaux, il n’y a encore beaucoup de place pour l’optimisation, comme des molécules biologiques différents exigent des conditions différentes.
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References
- Kotz, J., Treichel, P., Townsend, J. Chemistry and Chemical Reactivity. 8th ed. Brooks/Cole, Belmont, CA (2012).
- Arakawa, T., Timasheff, S.N. Mechanism of Protein Salting In and Salting Out by Divalent Cation Salts: Balance between Hydration and Salt Binding. Biochemistry. 23, 5912-5923 (1984).
