El ensayo de migración Transwell

Cell Biology
 

Summary

Migración de las células en respuesta a señales químicas es crucial para los Estados de desarrollo, inmunidad y enfermedades como el cáncer. Para cuantificar la migración celular, un simple ensayo fue desarrollado en 1961 por el Dr. Stephen Boyden, que ahora se conoce como el ensayo de migración transwell o ensayo de cámara de Boyden. Esta configuración consiste en un inserto que separa los pocillos de una placa de pocillos en compartimentos superior e inferior. Se siembran las células cuya migración debe ser estudiado en el compartimiento superior y la solución chemoattractant se coloca en el compartimento inferior. Después de la incubación, contar las células en el compartimiento inferior permite la cuantificación de la migración inducida por atrayentes.

Este video reseña el montaje experimental utilizado para estudios de migración celular. Entonces a destacar algunas consideraciones claves y esbozar un protocolo generalizado para correr un experimento que involucra las células adherentes. Por último, repasamos varias adaptaciones de esta configuración se utiliza actualmente para estudiar diferentes factores que afectan la migración.

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JoVE Science Education Database. Fundamentos de la biología celular. El ensayo de migración Transwell. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

El ensayo de migración transwell es una técnica clásica que permite a los científicos cuantificar el movimiento celular. Migración se refiere a la capacidad de una célula para moverse individualmente o en grupos. Movimientos celulares se hacen posibles a través de la reestructuración precisa de su citoesqueleto y migración ocurre generalmente en respuesta a los estímulos que actúan como señales.

Hoy, analizaremos el ensayo de migración transwell, que utiliza una configuración de cámara simple para evaluar la migración en respuesta a señales de atracción.

Empezaremos por proporcionar alguna información sobre la cámara transwell.

El aparato fue diseñado en primer lugar por el Dr. Stephen Boyden en 1961, que utilizó para estudiar la migración de leucocitos. Por lo tanto, este método también es conocido como el análisis de la cámara de Boyden.

En una simple cámara de Boyden, la pared exterior es de los pozos, como el de una placa de 96 pocillos. Dentro de cada pozo, se coloca un transwell, que es una pieza cilíndrica. El inserto tiene una membrana de policarbonato de un definido tamaño de poro. Cuando se coloca en el pozo, se divide la cámara en dos compartimientos. El compartimiento superior es donde se se siembran las células cuyo comportamiento migratorio es a estudiar, y el depósito de la parte inferior es donde se coloca la solución de chemoattractant. Por definición, un chemoattractant es una molécula que tiene la capacidad para promover la motilidad de la célula "atrayendo a las células".

Debido a estas fuerzas de atracción, las células en el compartimiento superior migran a través de los poros en el depósito inferior. Si las células tienen propiedades adherentes, como algunas células de melanoma, siguiendo el movimiento que se "peguen" en la parte inferior de la membrana. En este caso, la membrana puede ser fijo, manchados, y las células pueden contarse al microscopio. Por otro lado, las células no adherente, como esperma, migrará al depósito inferior. En este caso, las células en la solución de depósito pueden ser contadas con la ayuda de un hemocitómetro.

Aunque la configuración de este ensayo es simple, hay varias cosas que usted necesita considerar antes del experimento. Vamos a repasar algunos de ellos.

A partir de la solución de siembra, tiene que asegurarse de que la densidad está optimizada para observar la migración de la célula. También algunas células pueden resultar en migración indetectable, y mayores densidades a superpoblar la membrana, lo que es difícil enumerar la migración. La segunda consideración es el tamaño de los poros del relleno. Debe elegirse cuidadosamente dependiendo del tipo de la célula. Si el tamaño del poro es muy pequeño, las células serán incapaces de pasar a través.

Alternativamente, si el tamaño del poro es demasiado grande, las células sólo caerá a través, que no es la migración. Por último, uno debe ser consciente de la concentración de chemoattractant y la duración de incubación para la migración, ya que son interdependientes. Concentración óptima con el tiempo apropiado de incubación durante el cual el gradiente de concentración se mantiene entre los compartimientos, induce la migración de la célula debido a la quimio-atracción. Por el contrario, incubaciones prolongadas pueden acompañarse de un equilibrado de chemoattractant en toda la cámara conduce a la pérdida de gradiente químico, que puede confundir el análisis de los resultados obtenidos.

Con estas consideraciones en mente, vamos a discutir un protocolo que se utiliza para medir la migración de células adherentes.

Células a ensayarse se preparan en un medio libre de proteasa, ya que las proteasas pueden desnaturalizar receptores de membrana importante y en última instancia, afectan la migración. Después de que las células se preparan, la suspensión debe ser diluida a una densidad de siembra óptima. Para preparar la cámara, transwells se colocan en los pozos de una placa de pocillos. Suspensión de la célula debe pipetearse en el transwell sin tocar la membrana o la introducción de burbujas de aire.

Solución chemoattractant se pipetea en el depósito inferior, asegurándose de que la solución toque la membrana del inserto. El tiempo de incubación para la migración dependerá de las consideraciones experimentales. Tras la incubación, las membranas se fijan sumergiendo el inserto en etanol al 70%. Después de permitir que el inserto se seque, se agrega solución de tinción celular.

A continuación, las células se incuban durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, los insertos se lavan con la ayuda del tampón de lavado. Finalmente, la membrana puede ser suprimida y coloca en un portaobjetos de microscopio. Las células en la parte inferior de la membrana representan el número de células que han migrado en presencia y ausencia de atrayentes.

Desde entonces, ahora tienes una sensación para el protocolo, vamos a echar un vistazo a cómo los investigadores están utilizando este método en sus exploraciones.

Una de las aplicaciones más comunes de este ensayo es evaluar chemoattractant propiedades de compuestos desconocidos. Aquí, los científicos estaban interesados en examinar caminos de natación de los espermatozoides de la rana en la presencia de allurin, que es una sustancia secretada por los huevos de anfibios. Para ello, primero pipetea espermatozoides activos rana a la parte superior de los insertos transwell. Al fondo, ha añadido allurin. Después de permitir que las células migrar, contaron esperma en la solución de depósito bajo el microscopio. Usando esta técnica, eran capaces de generar una curva de respuesta de concentración que representa el efecto de la concentración allurin en la migración de espermatozoides.

Cuando una célula es atacada por patógenos, envía atrayentes para reclutar las células inmunes que migraran, adjuntar y posteriormente resolución la infección. Para probar este fenómeno, estos científicos cultivan células epiteliales en la parte inferior de los rellenos. Posteriormente, infectan estas células con diferentes cepas de bacterias. Finalmente, introdujeron las células inmunes en la cámara superior. Es conocido que las células infectadas producen varios atrayentes que inducen la migración de células inmunes. Los resultados de este experimento demostraron diferentes grados de la migración de neutrófila en respuesta a diferentes tipos de infección bacteriana.

Por último, la invasión de células de cáncer y metástasis a través de la matriz extracelular siempre ha intrigado biólogos de la célula. Aquí, los científicos querían determinar cómo específicos atrayentes pueden contribuir a estas migraciones a través de una matriz 3D. Genéticamente modificados dos piscinas separadas de células: una expresión de verde fluorescente y otra proteína fluorescente, rojo. Luego pipetea a una matriz extracelular-imitador a la cima de transwells.

Una vez solidificado, había invertida la transwell y había sembrado dos piscinas de la parte inferior de la membrana de las células. A continuación, que substituyó el inserto en la placa de pocillos y pipeta de la solución chemoattractant en la cámara superior. Esto causó que las células en la parte inferior para mover hacia arriba y a través de la matriz 3D. Con la ayuda de proyección de imagen confocal, estos investigadores reconstruyen migración celular en 3D y distinguen los patrones de migración de dos grupos de células.

Sólo ha visto video en el ensayo de migración transwell de Zeus. La comprensión de los componentes y el protocolo de este método, ahora sabes por qué es tan ampliamente utilizado por los biólogos de la célula. A pesar de la sencillez de esta configuración, la gama de configuraciones que puede adaptar este método es indispensable para estudios de motilidad celular. ¡Como siempre, gracias por ver!

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