Invasion de dosage à l’aide de Matrices 3D

Cell Biology

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Summary

La matrice extracellulaire (ECM) est un réseau de molécules qui fournissent un cadre structurel pour les cellules et les tissus et contribue à faciliter la communication intercellulaire. Techniques de culture de cellules en trois dimensions ont été développés pour mieux modéliser cet environnement extracellulaire pour in vitro de l’étude. Alors que nombreux prolongements cellulaires au cours de la migration à travers les matrices 3D sont semblables à celles requises pour le mouvement à travers des parois rigides 2D, ainsi que l’observation, migration à travers l’ECM exige également des cellules pour moduler et envahir ce polymère-treillis d’ECM.

Dans cette vidéo, nous allons présenter la structure et la fonction de l’ECM et les mécanismes fondamentaux de la façon dont les cellules migrent à travers elle. Ensuite, nous allons examiner le protocole d’un test pour la formation des tubes par les cellules endothéliales, dont les étapes peuvent être généralisés à d’autres expériences issus des matrices 3D. Nous terminerons en explorant plusieurs autres questions biologiques qui peuvent être adressées à l’aide d’analyses d’invasion ECM.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Notions essentielles de biologie cellulaire. Invasion de dosage à l’aide de Matrices 3D. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Les scientifiques ont développé des modèles 3D pour mieux étude invasion et émigration prolongements cellulaires. Alors que les systèmes de cultures cellulaires plus traditionnelles sont 2D, cellules de nos tissus existent dans un réseau 3D de molécules appelées de la matrice extracellulaire ou ECM. Alors que bon nombre des processus mécanistes requis pour la motilité cellulaire en 2D et 3D sont semblables, des facteurs tels que la rigidité réduite d’ECM par rapport aux surfaces plastiques, l’ajout d’une troisième dimension pour la migration et l’empêchement physique de se déplacer à travers les mailles de longs polymères dans l’ECM, tous présents différents défis à la cellule par rapport à la migration à deux dimensions.

Cette vidéo va présenter brièvement la fonction de base et la structure de l’ECM, ainsi que les mécanismes par lesquels les cellules modulent et migrent à travers elle. Ensuite, nous aborderons un protocole général utilisé pour étudier l’invasion des cellules endothéliales. Enfin, nous mettrons en évidence plusieurs applications des matrices 3D à l’étude des questions biologiques différentes.

Commençons par examiner la composition de l’ECM, et comment les cellules interagissent avec elle.

L’ECM effectue beaucoup de fonctions, comme soutien aux cellules, facilitant la communication intercellulaire et séparer les tissus. ECM composition varie selon les différents tissus et a des propriétés biologiques différentes, mais il peut être classé en deux grandes catégories. La membrane basale sert à ancrer et à séparer les tissus, tandis que la matrice interstitielle entoure et soutient les cellules d’un tissu. La matrice interstitielle est surtout composée de collagène protéine fibreuse, mais inclut également l’élastine et fibronectine.

Plusieurs processus biologiques doivent se produire pour les cellules à migrer sur l’ECM. Le premier est adhésion cellule-matrice, ce qui implique des protéines transmembranaires appelés intégrines. Ce lien l’ECM d’échafaudage intérieur de la cellule, appelée le cytosquelette.

Un autre processus est le réarrangement structural du cytosquelette de la cellule. Cela conduit à la formation de structures spécialisées appelées invadopodia, qui sont des encoches de la cellule dans sa matrice environnante. L’étape finale est la modulation de l’ECM. Cela implique généralement la dégradation molécules appelées métalloprotéases de la matrice ou MMP, qui s’accumulent dans l’invadopodia et dégrade l’ECM environnante, faciliter l’invasion des cellules. Analyses d’invasion de matrice 3D aux chercheurs de visualiser et d’étudier ce processus complexe.

Maintenant que vous êtes familier avec ECM et son interaction avec les cellules, parcourons un protocole pour l’étude d’invasion ECM par les cellules endothéliales de tubules de forme. En cultivant des cellules endothéliales dans un environnement 3D, on peut simuler le processus biologique de croissance des vaisseaux sanguins, également connu sous le nom de l’angiogenèse, qui est important pendant le développement normal, tant que le cancer.

Tout d’abord, endothéliales cellules sont cultivées, et une suspension monocellulaire est préparée en traitant les cellules avec des protéases comme la trypsine et eux en passant à travers un filtre à tamis à briser les agrégats cellulaires. La matrice 3D, généralement composée de collagène, fibrine, laminine ou des combinaisons plus complexes de ces composants — qui peut être préparé en laboratoire ou commandé auprès de fournisseurs commerciaux — sont décongelés puis sur la glace. Étant donné que la plupart des préparations ECM se polymérisent à des températures élevées, il est utile de garder au froid et autre matériel et réactifs. La suspension cellulaire est mélangée avec la solution de matrice décongelés pour incorporer des cellules, et ce mélange est placé dans un incubateur de culture cellulaire où la température plus élevée provoquera la matrice à polymériser.

Une fois définie la matrice contenant des cellules, des milieux de culture contenant des facteurs angiogéniques est ajouté dans le plat à matrice. Avec le logiciel Time-lapse de la microscopie, cellules individuelles peuvent être ensuite suivis afin d’observer leur migration à travers la matrice. Les images obtenues sont analysées, et les postes de cellules sont utilisées pour calculer la direction du mouvement et la distance en microns. Ces valeurs peuvent ensuite être tracées pour déterminer l’activité locomotrice, le taux moyen de migration des cellules. Enfin, formation de réseau de tubes est observée et analysé à l’aide de logiciel de visualisation pour identifier des fonctionnalités telles que des nœuds, des tubes et des boucles.

Maintenant, nous allons explorer quelques-unes des applications des matrices 3D dans des expériences spécifiques.

La migration cellulaire est médiée par la modulation active du cytosquelette cellulaire. Dans cette expérience, les matrices de collagène ont été préparés et mélangés avec une tache contenant une protéine fluorescente rouge permettant la visualisation. Les sphéroïdes de cellules individuelles, qui sont des agrégats cellulaires flottant, ont été isolés et enrobés dans la matrice de collagène. Après incubation, les cellules embarqués ont été colorés pour des composants spécifiques du cytosquelette et imagés par microscopie à fluorescence. Chercheurs ont observé des composants du cytosquelette et leurs altérations comme cellules migrent par l’intermédiaire de l’ECM.

Les scientifiques peuvent également étudier comment les propriétés de l’ECM affectent des migrations. Utilise un système de gel concentriques, où les cellules sont incorporés dans une matrice de gel interne entourée de matrices externes de diverses concentrations scientifiques peuvent suivre des cellules au microscope Time-lapse pour étudier leur migration du gel intérieur au gel initialement acellulaire externe. Chercheurs ont observé que la rigidité supérieure de gels de concentration plus élevées a entraîné une augmentation en déplacement de la cellule et une distance totale de la migration cellulaire.

Enfin, analyses d’invasion de matrice peuvent être effectuées au sein d’un animal vivant pour l’étude de l’angiogenèse dans un contexte spécifique à l’orgue. Ici, gels de fibrine — couramment utilisés en génie tissulaire en raison de leur nature biodégradable — ont été générés, suivie d’implantation dans les poumons de souris où les gels ont été maintenus en place par une « colle » de la fibrinogène de protéine. La migration cellulaire et la formation de vaisseaux sanguins étaient autorisés à se produire pour les suivants 7 à 30 jours, après quoi les poumons et les gels de fibrine ont été récoltés, fixe et sectionnés. L’imagerie de ces sections ont révélé des vaisseaux sanguins et la formation d’alvéoles dans les gels implantés, donnant des chercheurs Aperçu de cet aspect essentiel du développement pulmonaire dans son cadre en vivo .

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur les analyses d’invasion de la matrice extracellulaire. Cette vidéo a examiné la composition de l’ECM et comment les cellules migrent à travers elle, a présenté un protocole simple pour étudier la migration des cellules endothéliales à travers une matrice 3D et a mis en évidence plusieurs processus cellulaires, actuellement à l’étude dans le contexte des interactions cellule-ECM. Parce que la migration cellulaire endogène survient dans l’espace 3D, ces conditions biologiques sont mieux simulées par des techniques de culture 3D. Améliorations dans la composition de la matrice continuera de permettre aux scientifiques de répliquer avec plus de précision et d’étudier la migration cellulaire dans le laboratoire. Comme toujours, Merci pour regarder !

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