细胞表面生物素化测定

Cell Biology

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Summary

单元格可以调节其通过内吞作用后的细胞表面蛋白有效地隐藏在细胞质细胞膜上的特定蛋白量。一次在一个单元格中,这种表面蛋白可以摧毁或者"回收"回膜。细胞表面生物素化检测提供了一种方法来研究这些现象的研究人员。该技术利用的小分子生物素,可以添加标签表面蛋白,然后化学分解的衍生物。然而,如果表面蛋白 endocytosed,生物素衍生物将保护从解理。因此,通过分析融合不分裂,endocytosed 生物素标签,科学家可以评估内部表面蛋白的数额。

在这个视频中,我们审查生物素化测定,背后的概念钻研生物素衍生物的化学结构和其劈裂的机制。这被其次是一种广义的技术协议和最后,研究者是怎样目前使用它来研究不同细胞表面蛋白的动力学描述。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 细胞生物学精要. 细胞表面生物素化测定. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

细胞表面蛋白与生物素标记呈现研究细胞运输通路参与调控膜蛋白的有力工具。单元格保持一整套严格监管的蛋白质在表面,以便它可以接收和答复通过几个信号通路的胞外信息。内吞作用,一个过程的席卷,建议要涉及这些细胞表面蛋白调控造成他们内部化。因此,标记这些蛋白质之前他们就与代理 endocytosed 像生物素有助于科学家量化其国际化并研究其在细胞通路中的作用。

在这个视频中,我们将讨论的原则和细胞表面生物素化检测方法,并探索的科学家都在适应这种方法今天一些方式。

我们首先回顾一下细胞表面生物素化测定背后的原则。

正如前面提到的细胞用细胞内吞途径来调节的时空密度和表面蛋白的分布。内化的蛋白质被运通过特定的细胞通路,之后他们可以分流到溶酶体降解,或回收回细胞表面继续活动。细胞表面生物素化被为了衡量这些进程。

在这种测定方法,使用的标记生物素 — — 也被称为维生素 H — — 是一种水溶性的小分子。常用的表面标记实验生物素衍生物是磺酸-琥珀酰亚胺-SS-生物素,磺酸基、 N-羟基琥珀酰亚胺酯组、 二硫键,和当然生物素组成。让我们简化这巨大的结构通过将生物素替换字母"B"。

在此结构中磺酸基赋予强大的充电,使这种形式的生物素膜通透。通过添加到单元格保持是限制性的内吞作用的温度的磺酸-琥珀酰亚胺-SS-生物素标记的细胞表面蛋白。NHS 组上表面的蛋白质,与胺反应形成共价键。

然后,标记的细胞被移到是其间一些标记蛋白质会内化的内吞作用的允许温度。最后,细胞被移回限制温度停止内吞作用。为了具体量化内在的蛋白质,亲水、 膜通透的还原剂 — — 喜欢 L-谷胱甘肽 — — 添加。这将对 unendocytosed 磺基琥珀酰亚胺 SS 生物素,与双硫键反应而关闭劈开生物素组。在这一点上,其余的生物素化蛋白那些其标签被保护的还原剂,因为他们以前才能吸收。

细胞然后裂解,和 endocytosed 生物素化蛋白分离量化。通常加入人造珠涂上链霉亲和细胞裂解液进行分离。由于链霉亲和具有极高的亲和力,生物素,生物素化蛋白附着涂层的珠子。进行一系列的清洗步骤来消除污染的蛋白质,和最后洗脱步骤,释放绑定的蛋白质。靶标蛋白然后像印迹技术进行了分析。

因为现在你知道背后的生物素化检测的概念,让我们看看演示如何执行此过程可测量的表面蛋白内吞作用的广义协议。

开始与细胞冷却至 4 ° c。将它们放在冰保持是限制性的内吞作用的温度上。接下来,膜防渗磺酸-琥珀酰亚胺-SS-生物素试剂被添加,并且细胞孵育在黑暗中约 30 分钟。这可以有足够时间为生物素标签共价键附着在表面的蛋白质。细胞是从冰中删除,然后在 37 ° C 孵化了大约 30 分钟。在此温度下,生物素化表面蛋白质是 endocytosed。后孵化,细胞被冷却至 4 ° C,并添加一种亲水的还原剂,像 L-谷胱甘肽。这与双硫键反应并释放生物素组从标记,unendocytosed 蛋白质。

接下来,细胞的裂解用离心法,从而破坏细胞膜和暴露生物素标记的蛋白质。随之,裂解物添加到链霉亲和包裹小珠和生物素化蛋白被允许绑定。珠子用洗涤冷磷酸盐缓冲生理盐水和洗脱含洗涤剂和还原剂的缓冲区。这些试剂掉珠绑定的蛋白质变性和使他们恢复在洗脱液。在洗脱液中蛋白质双向凝胶电泳分离其分子质量的基础上。最后,西方印迹和探讨蛋白特异性抗体与污点允许可视化的靶蛋白。Endocytosed 蛋白质含量可以从生成的带密度量化。

现在,您了解细胞生物素化的方法,让我们看看它如何使用特定的实验。

这个生物素化协议最常见的应用是测量特定的细胞表面蛋白的细胞内吞率。在这里,科学家们感兴趣评价内在化的多巴胺转运蛋白或数据。通过遵循标准的协议,科学家们能够测量 endocytosed Dat 的百分比。这是代表免疫印迹显示车道 T,对应于"总量"蛋白内化,车道 S 是"剥离"样品细胞是永远不会允许继续通过内吞作用但车道与还原剂,治疗前我表示结果的"内部化"的蛋白质。

除了只测量的表面蛋白内吞作用,科学家们还研究药物对此过程的影响。在此研究中,研究人员评估与活化的蛋白激酶 C (PKC),诱使 DAT 内化表明其行动对治疗的反应的 Dat 的表面密度。科学家证实这所适应的体外生物素化协议在体外测定对小鼠脑组织中使用。数据显示大约 30%的损失的 DAT 从细胞膜 PKC 激活响应。

最后,通过调整生物素化测定,科学家还可以测量回收的膜蛋白。在这里,研究人员正在调查表面通道蛋白,CFTR,负责进行氯离子。评估回收,研究人员在一组单元格,执行标准生物素化协议并通过裂解从 unendocytosed 表面蛋白生物素后添加步骤修改议定书 》 的第二组的细胞。这些额外的步骤,包括提高温度 37 ° C,以允许回收的一些的内化,生物素标记的受体蛋白。通过计算内在蛋白质回收发生前后之间的差异,这些科学家们能够量化 %cftr 循环回膜。

你只是看着朱庇特的简介细胞表面生物素化测定。视频描述了这种测定方法的程序步骤和解释发生在每一步的反应。最后,我们探讨了一些示例实验表明这种方法的适用性。一如既往,感谢您收看 !

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