Overview
アネキシン V と propidium 染色ヨウ化 (PI) は、細胞死の種類を識別する方法と研究者を提供-壊死やアポトーシス。この手法は、2 つのコンポーネントに依存します。アネキシン V、最初の phosphatidylserines、通常細胞の膜の内側、細胞質向けのリーフレットでのみ発生がなる「反転」外側のリーフレットにアポトーシスの初期段階と呼ばれる特定のリン脂質に結合する蛋白です。2 番目のコンポーネントは、羊膜が破裂したときだけセルを入力できます DNA 結合色素分子 PI-後半アポトーシスとネクローシスの特徴。
このビデオ資料アネキシン V と PI 染色、背後にある概念の確認から始まるし、染色の差分パターンを強調する異なる死経路を進んでいるセルを区別する使用ことができます。我々 は、研究者が現在使用してアネキシン V と PI 染色細胞死を理解する方法の説明が続くこのテクニックを一般化されたプロトコルを確認します。
Procedure
アネキシン V と propidium ヨウ化 (PI) 分類細胞の細胞死を識別し、その様々 な経路を区別するための技術である: アポトーシスまたはプログラム細胞死と壊死。セルは、明瞭な形態学的変化経路を受けます。アポトーシスや壊死を受ける細胞につながる特定の条件を識別することによって科学者は、細胞生理学への洞察力と病の病態生理を得る。アネキシン V と PI ラベリング、フローサイトメトリーに続いて、細胞死の型を分類する最も効率的な方法の 1 つとして設置が。
今日、この試金が細胞死経路の同定に役立つ方法を説明します、この手法と細胞生物学の分野で重要な質問にお答えするこのメソッドを使用していくつかのエキサイティングな例の実験を実行する方法。
まず、アネキシン V と PI 染色原理を見てみましょう。
前述したように、アポトーシス細胞は形態学的特徴を示します。セルの縮小、膜ブレブ、核の断片化、およびアポトーシス小体の出現が挙げられます。さらに、アポトーシスの誘導、次-つまり、アポトーシス初期-膜の特定の特性の変化が表示されます。通常の細胞膜は内部のリーフレット、すべてのホスファチジルセリンまたは PS の残余。ただし、初期のアポトーシス細胞におけるこれらの PS の残基のいくつかが転外面-がどのようにですか?
それを理解し、戻って一歩を踏み出してこと。アポトーシス、細胞内のカスパーゼがアクティブ化されるように知られています。これらの酵素はターンでは scramblase と呼ばれる膜結合酵素を有効にします。Scramblase は、外側の表面に細胞質側から PS 残渣を透過して細胞膜を「スクランブル」。対照的に、壊死 PS 中残基残っているが、膜自体が破裂します。アネキシン V と PI ラベリングは、細胞死の 2 つのタイプの膜変化のこれらの相違を活用します。
かになどの蛍光色素を共役アネキシン V-FITC としてよく知られている-膜の不浸透性、天然リガンドは、PS したがって外在 PS へ結合することにより初期のアポトーシス細胞を簡単に識別しかし、膜破裂、壊死中ともアポトーシス、アネキシンの後の段階で発生します、内面の PS にバインドも、偽陽性をもたらすが。
これを避けるには、科学者たちは、PI を使用します。この DNA 結合色素分子が再び、不透水性の膜と細胞膜が破裂するときのみセルに入力することができます。したがって、セルが染色は唯一アネキシン PI、アネキシン ステンド グラスの両方のセルができる壊死または後半のアポトーシスに対し早期アポトーシスです。
このアッセイの背後にある基本原則を学んできた、今では、染色と細胞死の分析の手順を行ってみましょう。
まず、セルが収穫され任意の形態の破壊を防ぐために低速で遠心分離、およびリン酸緩衝生理食塩水、またとして知られている PBS など生理学的洗浄バッファーで再停止されます。別の遠心分離のステップ、次のセルは再停止されるアネキシン V で FITC と共役アネキシン PS. アネキシン V へのバインドに必要なカルシウムを含む結合バッファー、アネキシンと PS 協会を許可する暗闇の中で部屋の温度で培養したソリューションに追加されます。次の手順で PI は直接アネキシン染色細胞液に追加し、暗闇の中で培養しました。インキュベーション後、細胞遠心沈降法による PBS で洗浄、洗浄バッファーで再停止される、氷で保たれます。今彼らは分析の準備ができています。
細胞の蛍光活性は、フローサイトメトリー、蛍光単一の流体の流れの中断のセルからデータをキャプチャするレーザー ベースの手法によって分析されます。個別に各染料で染色細胞を用いた蛍光のキャリブレーション後デュアル染色細胞からデータが取得されます。セル人口からの蛍光信号が対数軸の対数の y 軸上の PI のアネキシン バインド FITC 強さのプロット、プロットを作成する使用されます。アネキシン FITC 陽性および否定的な PI がクラスター、プロットの右下側に早期アポトーシス細胞を表す、アネキシン FITC と PI 細胞二重陽性が後半アポトーシスや壊死細胞を表す右上に発生しますされているセル。無染色または些細アネキシンと PI のステンド グラスのままセル ライブ セルです。
以来、なぜ細胞生物学者は細胞死を勉強するこの手法に頼る今知っている、なぜ我々 のレビューはありません一部のアプリケーション。
この手順を使用して、科学者は、細胞内のタンパク質は、アポトーシスに関与しているを従うことができます。このビデオでは、研究者は、抗がん剤、シスプラチンの腎細胞にアポトーシスを誘導するかどうかを参照してくださいに及ぼす影響を分析しました。セルの 1 つのセットはノザン酵素蛋白質キナーゼ C、アクティブなフォームまたは PKC に導入された、その他のセットされた非機能的なフォーム増殖型-支配的な負の PKC。細胞の PKC を表現し、シスプラチンを投与したが、時間をかけてアポトーシスを施行した非アクティブの支配的な負の PKC を発現する細胞が酵素がシスプラチンによるアポトーシス誘導経路の重要なプレーヤーであることを示す、アポトーシス抵抗性。
研究者はまた特定の T 細胞の細胞毒性の可能性をテストするのにはこれらの汚れを使用します。細胞傷害性 T 細胞は、標的細胞の特定の膜タンパク質を認識し、それへのバインド時にその死を誘導できます。ここでは、研究者は培養アネキシン V 標的腫瘍細胞と抗原特異的 T 細胞と T 細胞関与による腫瘍細胞のアポトーシスの誘導を観察。流れの cytometry のデータでは、細胞傷害性 T 細胞の有無でターゲット細胞死の割合を明らかにしました。
最後に、科学者は、次の遺伝子導入細胞の生存率を評価するのにこのメソッドを使用します。この場合、研究者は nucleofection 後の細胞生存率を評価したい — これにより遺伝子配達を促進する細胞と核の膜の細孔過渡を作成する化学物質と適用された電界の組み合わせを使用する方法。アネキシン V プラス染料を使用 7 aminoactinomycin D または、PI のようにバインドする DNA、彼らは apoptosis か壊死によって引き起こされる nucleofection 低細胞死を示した 7 AAD 呼び出されます。
アネキシン V と PI のラベリングにゼウスのビデオを見てきただけ。このビデオで我々 簡潔にアポトーシスとネクローシス細胞の特徴を説明、このメソッドの背後にある原則を見直し、このための一般的な手順や使用される手法、いくつかのアプリケーションをプレビューを見ています。どのように異なる細胞を理解することの重要性を与えアネキシン V と PI のラベル付け、さまざまな条件の下で死ぬ重要なツールとしての機能細胞生物学者この現象に興味を持ってします。いつも見てくれてありがとう!
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