Overview
Eines der Markenzeichen der Apoptose ist die nukleare DNA-Fragmentierung durch Nukleasen. Diese Enzyme werden durch Caspasen, die Familie der Proteine aktiviert, die die Zell-Tod-Programm ausführen. TUNEL-Test ist eine Methode, die nutzt diese Funktion um Apoptotic Zellen zu erkennen. In diesem Test katalysiert ein Enzym namens terminal Deoxynucleotidyl Transferase die Zugabe von dUTP Nukleotide an den freien 3' Enden des fragmentierten DNA. Mithilfe von dUTPs, die gekennzeichnet sind mit chemischen Tags, die Fluoreszenz oder Farbe produzieren können, können apoptotische Zellen gezielt identifiziert werden.
Jupiters Video auf der TUNEL-Test beginnt indem wir diskutieren, wie diese Technik verwendet werden kann, um Apoptotic Zellen zu erkennen. Dann gehen wir durch ein allgemeines Protokoll für TUNEL-Assays auf Gewebeschnitte und Visualisierung der Ergebnisse mit Fluoreszenz-Mikroskopie. Schließlich werden mehrere Anwendungen des Assays in die aktuelle Forschung abgedeckt werden.
Procedure
Der TUNEL-Test wird am häufigsten verwendet, um Zellen Apoptose, die eine Form des programmierten Zelltods ist zu erkennen. Apoptose ist ein wichtiger biologischer Prozess, während der Entwicklung und für die Aufrechterhaltung der Homöostase der Gewebe. TUNEL Färbung ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung der Apoptotic Zellen. Dies hilft Wissenschaftlern Wirksamkeit neuer Behandlungsmethoden für Krankheiten zu testen, in denen Apoptose entweder gehemmt wird, wie bei Krebs, oder verbessert, wie in Neurodegeneration.
Dieses Video erklärt, wie der TUNEL-Test verwendet werden kann, um Zellen Apoptose, eine Schritt für Schritt Protokoll zur Durchführung dieses Verfahrens in Gewebeschnitten, bezeichnen und wie Forscher diese Technik, um die Mechanismen des Zelltods, anwenden.
Vor dem Eintauchen in das Protokoll den TUNEL-Assay, sprechen wir über die Prinzipien, die hinter dieser Technik.
Eines der vielen Kennzeichen Merkmale der Apoptose ist DNA-Fragmentierung. Wie tritt DNA-Fragmentierung? Apoptose erfolgt durch Enzyme genannt Caspasen in das Zytosol vorhanden. Ihre Hauptaufgabe ist die Proteine zu Spalten, um die Zelle zu demontieren. Darüber hinaus Caspasen aktiviert ein Enzym, genannt Caspase aktivierte DNase, CAD, durch lösen sie aus ihrer Inhibitor — ICAD. Aktivierte CAD ist eine Endonuklease, die Reisen in den Zellkern und bindet sich chromosomalen DNA.
Spaltung von DNA bewirkt letztlich Anhäufung von DNA-Fragmenten mit geklaut enden, und die TUNEL-Assay Eindringmittel Etiketten diese Enden der fragmentierten DNA, so dass Wissenschaftler um Apoptose zu erkennen eingekerbt. Aber wie kommt es dazu? Dafür müssen Sie die TUNEL-Reaktion zu verstehen. TUNEL steht für terminal Deoxynucleotidyl Transferase-vermittelten dUTP Nick-End bezeichnen. Die zwei wichtigsten TUNEL Reagenzien sind terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT, und Deoxyuridine Triphosphat oder dUTP, die zur leichteren Erkennung Eindringmittel beschriftet werden kann.
Um die TUNEL Reaktion verstehen, gehen Sie wir zurück zu den apoptotischen Zellen mit DNA-Fragmente. Diese Fragmente geklaut haben freie 3 '-Hydroxyl-Gruppen. Nach dem Hinzufügen der TUNEL Reagenzien zu einer Probe mit Apoptotic Zellen legen das Eindringmittel beschrifteten dUTPs auf diese 3 '-Hydroxyl-Gruppen mit Hilfe des Enzyms Katalysator TdT. Die Zellen befleckt mit diesem Verfahren werden TUNEL-positiven Zellen, genannt, die dann mit Fluoreszenz-Mikroskopie visualisiert werden können.
Nun, Sie die grundlegenden Prinzipien und Konzepte, die hinter der TUNEL-Test verstehen, lassen Sie uns beschreiben ein allgemeines Protokoll für die Durchführung dieser Technik in Gewebeschnitten. Die wichtigsten Schritte der TUNEL-Test gehören Fixierung des Gewebes von Interesse, Permeabilisierung der Gewebe, Hinzufügen von TUNEL Reagenzien, stoppen die TUNEL-Reaktion, und schließlich die Analyse.
Erstens ist das Gewebe des Interesses festzusetzen, um biologische Strukturen zu bewahren. Fixierung durch Vernetzung Proteine in den Zellen funktioniert. Zum TUNEL-Test können Gewebe fixiert werden, indem sie zu einer Lösung mit 4 % Paraformaldehyd für 4-24 Stunden bei 4° c Nach der Fixierung, Cryosection Gewebe in dünne Scheiben von 10 µm oder weniger.
Der nächste Schritt ist Permeabilisierung, die Reagenzien wie das TdT-Enzym ermöglicht, den Zellkern einzudringen. Permeabilisierung der Gewebeschnitte kann erfolgen, indem das Gewebe zu Proteinase K-Lösung für 5 – 15 Minuten bei 37° C. Spülen Sie Gewebeschnitte mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung auf einem Orbitalschüttler für 15 – 30 Minuten bei Raumtemperatur.
Nach Permeabilisierung TdT Enzym und Gewebekulturen beschrifteten dUTPs dazu Gewebeschnitte, zusammen mit einer Kennzeichnung Puffer, enthält Kobalt, das fungiert als Cofaktor für die Reaktion von TUNEL. Zusammen, sind das Reaktionsgemisch TUNEL Abschnitt Gewebe für 1 – 3 Stunden bei 37° C inkubiert und geschützt vor Licht, Fluoreszenz vor dem Ausbleichen zu verhindern.
Nach Inkubation Stop-Puffer wird zum Abschnitt Gewebe um die TUNEL-Reaktion nicht mehr hinzugefügt, und nach einer kurzen Inkubationszeit der Abschnitte werden gewaschen, mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung. Zu guter Letzt werden Gewebeschnitte gebeizt mit Gewebekulturen tagged dUTP visualisiert mit Fluoreszenz-Mikroskopie und bewertet für die Lokalisierung von TUNEL positive Zellen in einem bestimmten Gewebe. Man kann Zelltod quantifizieren, einfach durch zählen den Anteil der TUNEL positive Zellen in einem bestimmten Gewebe-Abschnitt.
Nun, da Sie wie den TUNEL-Test um Apoptotic Zellen erkennen durchgeführt gesehen haben, lassen Sie uns besprechen, wie dieser Assay verwendet werden kann, von Zellbiologen gestellte Fragen anzusprechen.
Zelltod tritt als ein normaler Bestandteil der Entwicklung für die Formung von Geweben und Strukturen und für die Beseitigung von unnötigen Zellen. Daher interessieren sich Wissenschaftler dieses Phänomen-Studie die Auswirkungen der pränatalen Exposition gegenüber verschiedenen Substanzen auf Apoptose während der Entwicklung. Hier interessierte Wissenschaftler untersuchen die Wirkung von Alkohol pränatale Exposition auf die Entwicklung des Gehirns. Die Ergebnisse der TUNEL Färbung durchgeführt auf fetale Gehirn ergab erhöhte Apoptose in Geweben, die Alkohol, im Vergleich zu Kontrolltieren pränatal ausgesetzt waren.
Wissenschaftler nutzen auch den TUNEL-Test, um Apoptose in Reaktion auf eine bakterielle Infektion zu untersuchen. In diesem Experiment entwickelten Wissenschaftler ein Modell der Lungenentzündung durch die Injektion von Mäusen mit Pseudomonas Aeruginosa, die Lungenentzündung induziert. Dann Lungengewebe entfernt wurde und TUNEL Färbung wurde durchgeführt, um Apoptose als Reaktion auf die bakterielle Infektion zu untersuchen. Ergebnisse zeigen, dass apoptotischen Zelltod bei Mäusen ausgesetzt, die Bakterien im Vergleich zu Kontrolltieren erhöht.
Zu guter Letzt TUNEL Färbung auf menschliche Tumorproben einsetzbar um Tumor Reaktion auf Medikamente zu bestimmen. In diesem Beispiel wurden Tumorproben von menschlichen Patienten geerntet und ex Vivo kultiviert. Sie waren als nächstes mit der präklinischen Medikamenten behandelt und für eine Antwort mit der TUNEL-Test bewertet. Gewonnenen Daten zeigen, dass die Behandlung mit einem Medikament, das Hitze-Schock-Protein 90 deutlich hemmt Apoptose im Tumorgewebe erhöht.
Sie sah nur Jupiters Video über die Verwendung des TUNEL-Tests, um Zellen Apoptose zu erkennen. Dieses Video überprüft die Prinzipien hinter TUNEL Färbung und eine Schritt für Schritt Protokoll den TUNEL-Test auf Gewebeschnitte durchführen. Wir überprüfen auch, wie diese Methode angewendet werden könnte, um den programmierten Zelltod während der Entwicklung und Krankheit zu verstehen. Wie immer vielen Dank für das ansehen!
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