ATP 生物荧光法测定

Cell Biology

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Summary

萤火虫,在荧光素酶酶转换成氧化荧光素,叫荧光素的化合物并因此产生光或"发光"。这种反应需要能量来源于 ATP 要继续进行,所以研究人员利用荧光素酶-荧光素相互作用来衡量细胞 ATP 含量。鉴于 ATP 的作用作为单元格的货币的能量,ATP 生物发光技术可以提供洞察细胞代谢和细胞的整体健康。

在这个视频中,朱庇特讨论细胞呼吸,专门审查葡萄糖代谢在 ATP 生产的结果。这被其次是 ATP 生物发光技术和广义的协议,这种技术背后的原理。最后,一项调查研究人员是怎样目前使用 ATP 生物发光技术来评估细胞活力在各种实验条件。

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JoVE Science Education Database. 细胞生物学精要. ATP 生物荧光法测定. JoVE, Cambridge, MA, (2020).

ATP 生物发光技术是一种常用的技术,用于定量 ATP 水平和生活、 新陈代谢活跃细胞检测。ATP 或三磷酸腺苷是所有生物能源的主要来源和"所有"我们指的是所有。在细胞水平上,ATP 生成通过一组称为细胞呼吸作用的代谢过程。

今天,我们将简要讨论参与细胞呼吸作用的的途径。接下来,我们会介绍 ATP 生物发光技术,背后的原则并通过执行这个方法一步一步的协议。最后,我们将看到如何科学家们正应用这一技术在他们当前的研究。

让我们首先通过引入细胞呼吸作用。这种现象涉及到几个的代谢过程,但我们会专注于处理葡萄糖代谢的一个。

在细胞质,糖酵解途径将葡萄糖转换为丙酮酸,和在过程中会生成两个 ATP 分子。丙酮酸被运输到线粒体,在那里它转化为乙酰辅酶 A — — 一个还会生成二氧化碳的过程。虽然仍然在线粒体,乙酰辅酶 A 则进入三羧酸或三羧酸循环,在此期间再次生成二氧化碳,作为是高能的分子 NADH 和 FADH2。这些分子最终"带入"电子的电子传递链或等。

内等,电子按顺序转移之间不同的蛋白复合物在线粒体内膜之前将氧气转换为水。在此过程中,质子是"注入"线粒体膜间隙。ATP 是实际生产时这些质子进回到线粒体基质,当他们通过一种叫 ATP 合酶蛋白质。在一起,三羧酸循环和等导致 36 ATP 分子的合成。其他营养的分子,如脂肪和蛋白质的分解也可以纳入的 TCA 循环等,导致 ATP 生产。

现在,我们知道如何细胞产生 ATP,让我们了解 ATP 生物发光技术,一般用来测量这种分子的细胞内水平背后的原则。

ATP 在结构上,有腺嘌呤基地、 核糖糖和三个磷酸基团 — — 后者由高能债券连接。这些债券释放能量时破碎,和 ATP 生物发光技术利用这种能量。

基本上,这种测定方法需要荧光素的化合物,是索取,像萤火虫那样"容光焕发"生物,和其相应的催化剂酶称为荧光素酶。氧气,荧光素酶从 ATP 提供能量,转换成氧化荧光素的荧光素。这种反应的副产物是焦磷酸盐,是两个磷酸基团从 ATP 获得 — — 将其转换为一磷酸腺苷或放大器 — — 二氧化碳,和光或发光。发光的照度计,量化光发射机器读取。由于发光产生量的 ATP 含量成正比,这是一个好的细胞活性及代谢指标。

现在,您了解 ATP 生物发光技术背后的原则,让我们概述一般的协议。

首先,种子细胞的包含文化媒体的 96 孔板中。细胞被镀在不同密度下一式三份,占密度变化。由于最外层井不包围其他所有四个边的井,这口井的温度和蒸发率可能变量。因此,细胞外的井,不镀,取而代之的是他们都充满水,以避免可能会影响反应的板宽蒸发和温度变化。在 37 ° C,使细胞要坚持培养板板然后孵一夜之间。

然后,删除了媒体,荧光素酶和荧光素添加给每个井和板放在摇床 5 — — 15 分钟,以促进反应。接下来,将混合物从每口井的一部分转移到白色 96 孔板;白板通常用作它们反射光线向上,允许提供更精确的发光读数。此外,应避免泡沫,因为它们可能会干扰随后的分析。作为发光信号可以降低随着时间的推移,在照度计 10 – 12 分钟内读完盘子。

以照度计结果进行了分析,从井和相同的细胞密度计算平均发光值。通过比较发光数据收集以这种方式从健康对照样品和处理的细胞,研究人员可以评价具体的治疗对活性及代谢的影响 — — 特别是通过寻找降低发光实验组。

现在,您已经看到如何执行 ATP 生物发光技术,让我们来讨论其研究应用程序。

科学家一直试图开发新的抗病毒药物,不要伤害或杀死宿主细胞。在此研究中,种子在多井板和一个特定的病毒感染哺乳动物细胞。各类抗病毒化合物被添加到这些样品,并且生成日志浓度响应曲线计算有效浓度五十或 EC50。EC50 是在哪个单元格可行性是 50%种化合物的浓度。这是一个常用的参数,以评估一种化合物的毒性。

ATP 水平也可以产生线粒体的活性,在各种条件下的线索。在这里,ATP 生物发光技术进行筹备工作的线粒体来自啮齿类动物的肝脏和肌肉细胞,帮助研究者评估在正常组织中线粒体功能的程度。重要的是,可以扩展此协议提供一种方法,研究线粒体功能的疾病状态。

科学家还在使用这种测定方法探讨潜在癌症治疗体内系统中。在此示例中,人类肿瘤细胞表达荧光素酶改性,注入活老鼠的大脑。肿瘤细胞成为了建立在这些动物后,他们对待一种抗癌药物。随后在体内ATP 生物荧光法测定显示,药物暴露小鼠肿瘤细胞 ATP 水平较低。

你刚看了朱庇特的 ATP 生物发光技术简介。你现在应该熟悉的细胞呼吸作用的途径和用来测量 ATP,是这些通路的最终产品的协议。ATP 生物发光技术作为优秀筛查工具细胞生物学家感兴趣研究生理和病理因素对细胞新陈代谢和生存能力的影响。一如既往,感谢您收看 !

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